最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1

G418筛选稳定表达细胞系PROTOCOL

1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。

2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。

3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。

4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。

5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。

方法同4。

6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。

在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。

假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。

比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。

这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。

通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。

a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。

c 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。

G筛选稳定表达细胞系经验总结图文稿

G筛选稳定表达细胞系经验总结Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。

有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。

加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结2

最全的G418筛选稳定表达细胞系2前言在分子生物学领域中，稳定表达细胞系的制备是非常重要的。

而在制备稳定表达细胞系的过程中，G418耐受性筛选是最常用的一种方法。

本文就该方法进行细致的，希望对大家有所帮助。

G418的作用G418是一种广泛应用于细胞培养中的抗生素。

G418的主要作用是通过破坏靶细胞的核糖体的功能而发挥抗生素活性。

这依赖于靶细胞中的耐药性基因，通常经过转染或整体基因组编辑获得。

这些基因通常会转录RNA，并翻译成与蛋白质功能无关的药物代谢酶或其他抗性蛋白质。

筛选细胞系的基本流程G418的筛选过程是稳定表达细胞系的一部分。

经过瞬时转染或电穿孔后，与转染物质中的DNA共染色板并内化进入细胞。

在内化过程中，染色体或质粒DNA 可以在总体上被细胞机制视为异物并准备将其解除。

其中的一个解除机制是通过解除转录RNA，从而将它们从蛋白质生产途径中移除。

G418抑制暴露在表面的核糖体中的修饰基队的蛋白质的生产。

如果细胞体系不具有反抗力机制，则G418会破坏细胞并导致细胞死亡。

然而，通过特定酵母的CUP1锌指转录因子同源工程，使其对G418转化为一种有效的ATP结合剂，从而打开药物代谢酶表达。

可以在这些细胞中选择表达具有耐药性G418药物代谢酶的细胞，并在含有适量G418的培养基上进行培养和筛选。

筛选条件的优化G418抗性筛选过程具有一定的体系依赖性，因此筛选条件需要在洗脱和拍摄步骤之后进行优化。

根据选择的细胞线，典型的筛选条件是0.5mg/ml浓度的G418和2-4周的境况培养。

但是，这些条件可能需要优化以适应特定试验条件，例如在分子克隆中需要更强的选择并且可能需要更长的选育时间。

考虑到选择压连续存在的潜在影响，推荐根据具体情况进行测试并确定适当的药物添加量和持续时间。

稳定表达细胞系的优点与瞬时转染相比，生成稳定表达细胞系有很多优点。

首先，它们可以被保存和用于长期研究，免受数据库变化和反常的实验结果的影响。

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结2

Protocal1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。

2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。

3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。

4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。

5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。

方法同4。

6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。

在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。

假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。

比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。

这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。

通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。

a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。

G筛选稳定表达细胞系经验总结

G筛选稳定表达细胞系经验总结Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。

有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。

加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

g418筛选细胞原理

g418筛选细胞原理一、引言在生物学研究中，细胞是一个非常重要的研究对象。

为了更好地理解细胞的功能和特性，科学家们经常需要筛选出特定类型的细胞。

本文将重点介绍一种常用的细胞筛选方法，即使用g418进行筛选的原理。

二、g418的作用机制g418是一种广谱抗生素，属于氨基糖苷类抗生素，常用于细胞筛选和基因转染实验。

它能够抑制细菌和真菌的生长，同时对哺乳动物细胞具有选择性毒性。

g418的作用机制主要是通过抑制细胞内的蛋白质合成而起作用。

三、g418筛选细胞的原理g418筛选细胞的原理是利用细胞对g418的敏感性来筛选出特定类型的细胞。

在细胞培养基中加入一定浓度的g418，只有对g418敏感的细胞才能够存活下来，而对g418不敏感的细胞则会死亡。

因此，通过调整g418的浓度，可以选择性地杀死或保留特定类型的细胞。

四、g418筛选细胞的步骤1. 准备细胞培养基：在培养基中添加适量的g418，使其浓度达到所需浓度；2. 培养细胞：将待筛选的细胞加入带有g418的培养基中，进行培养；3. 观察细胞生长：观察细胞在带有g418的培养基中的生长情况。

对于对g418敏感的细胞，它们将在培养基中存活和繁殖；而对g418不敏感的细胞，则会死亡或生长缓慢；4. 筛选细胞：根据细胞的生长情况，筛选出对g418敏感的细胞。

五、g418筛选细胞的注意事项1. g418的浓度要根据具体实验目的进行调整，过低的浓度可能无法有效筛选出特定细胞，而过高的浓度可能对所有细胞都具有毒性；2. g418的作用时间也需要根据实验目的进行调整，通常需要持续培养一段时间才能筛选出对g418敏感的细胞；3. 在筛选细胞的过程中，需要定期观察细胞的生长情况，及时调整培养基中的g418浓度，以保证细胞的生长和筛选效果。

六、g418筛选细胞的应用g418筛选细胞的方法在生物学研究中得到了广泛应用。

例如，在基因转染实验中，可以利用g418筛选出成功转染的细胞，以便进行后续的功能研究；在细胞分离和纯化实验中，也可以利用g418筛选出特定类型的细胞，以便进一步研究其特性和功能。

转染、G418筛选、单克隆化的总结

转染、G418筛选、单克隆化的总结筛选之前确定G418浓度：1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。

这时药物浓度可以降至200ug/ml。

2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1

原理分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。

外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。

极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。

细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。

由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。

一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。

细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。

G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。

是稳定转染最常用的选择试剂。

当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。

Ｇ418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。

其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。

但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。

我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。

因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。

所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。

G418筛选稳定表达细胞系构建技术原理

G418筛选稳定表达细胞系构建技术原理原理分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。

外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。

极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。

细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。

由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。

一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。

细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。

G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。

是稳定转染最常用的选择试剂。

当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。

Ｇ418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。

其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。

但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。

我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。

因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。

转染、G418筛选、单克隆化的总结

1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%加药时间和维持浓度2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。

一般是转染48小时后加入抗生素。

挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。

筛选时的培养液1，死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液3，适当增加血清浓度。

1，问题1。

做hela细胞的筛选，现在已经筛选3周，在6孔板中已经长出一些细胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和周围的其它细胞簇融合在一起（我的细胞簇离的很近），就是说几个细胞簇被胰酶融合在一起，那样根本没有办法做下去了，该怎么办？b、加入胰酶后，稍过几秒钟就可以吸走消化液了，不用吸干净，然后放到37度温箱中继续作用1MIN，这时，消化酶可以继续作用的，又可避免胰酶扩散；d、具体消化的时间，你注意摸索一下，如果在步骤2中显微镜下见细胞尚未完全松散开，可以再重复的，直到松散开，能够被吸走为止。

2，问题2。

筛选成功的概率：只要有抗性加压筛选，挑选到的机率还是比较大的。

一般能挑到稳定表达的概率我认为大概有70－80％，但是想挑到表达量高且能稳定表达的，不大容易。

这个可能是在染色体上，合适的整合位点太少的缘故。

想请教各位有经验的高手，你们做稳定转染时有此发现吗？我的也是，而且好象还有好几种不同类型的细胞。

不过，我转的是一种抑癌基因。

5，从单克隆化时开始，就要加大营养，血清清和生长因子。

方法1：单克隆细胞的培养就是这样的,我现在作了15个96孔板的单克隆,总共才得到大约50株单克隆在做时候应保证每个孔中的细胞是一个,因此,我一般在200毫升的培养液中加入小于96个的细胞,这样平均到每个孔中因该可以由满意的结果你所说的现象我也遇到过,我也百思不得其解,只好做多一点的96孔板来补充。

G418筛选

从G418筛选，转染到单克隆化的总结筛选之前确定G418浓度：1.由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

加药时间和维持浓度1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。

这时药物浓度可以降至200ug/ml。

2.加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。

稳定细胞株筛选药物浓度确定方法

稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。

对于一些常见的细胞系，通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。

例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。

用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。

对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。

不同批次的药物活性有一定差异。

因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。

筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。

第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素（0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml）加入。

2、用G418筛选处理5-10天。

每2天观察细胞一次。

每4天跟换新的有抗生素的培养基（如果有必要可以更换得更勤）。

直到得到最佳浓度。

3、用嘌呤霉素处理4-7天。

每2天跟换新的有抗生素的培养基。

G418筛选

G418筛选G418、新霉素与neoG418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo 就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。

筛选之前由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

看下面的一个试验:3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

所以汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% ～加药时间由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早;但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。

这时药物浓度可以降至200ug/ml。

培养液加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。

这时会出现两个问题:1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结3

最全的G418筛选稳定表达细胞系G418是最常用的筛选剂之一，可用于筛选稳定表达的质粒载体含G418抗性基因的细胞系。

在这篇文档中，我们将介绍如何进行G418筛选，以及如何评估稳定表达的细胞系。

G418的使用G418是一种广谱抗生素，能够影响细胞内的核糖体功能。

在含有G418抗性基因的质粒载体中，这一基因将在细胞内表达，从而使细胞对G418具有抗性。

因此，通过加入G418到培养基中，可以筛选出含有G418抗性基因的细胞。

G418的浓度和作用时间很重要。

一般情况下，使用0.4 ~ 1 mg/mL的G418浓度，作用时间为72小时。

当G418加入到培养基中后，需要每两天换一次培养基，并检查细胞生长情况。

如何评估稳定表达的细胞系进行G418筛选后，需要评估哪些细胞系是确实稳定表达了目标基因。

以下是常用的评估方法：1. RT-PCRRT-PCR是常见的定量分析方法之一，可以用于测量目标基因在细胞中的表达水平。

通过提取RNA，用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后用PCR来放大目标区域。

在最后的荧光测量中，可以测量出目标基因的表达水平。

RT-PCR的优点是灵敏度高，且可以针对不同寡核苷酸的序列进行定量分析。

2. Western BlotWestern Blot是常见的蛋白质分析方法之一，可以用于测量目标蛋白在细胞中的表达水平。

通过提取蛋白质，将其分离成各种大小不同的片段，然后用抗体来特异地检测目标蛋白。

Western Blot的优点是能够定量分析特定蛋白，且具有较高的灵敏度。

3. 细胞功能实验在某些情况下，需要通过测量细胞的功能来评估细胞系的稳定表达水平。

例如，对于表达了RNA干扰分子的细胞系，可以通过测定下游基因的表达量或细胞增殖率来检验RNA干扰是否成功实现。

G418筛选稳定表达细胞系是一种常见的实验方法。

在筛选前，我们需要准备含有G418抗性基因的质粒载体，然后在适当的时间和浓度下进行G418筛选。

G418筛选稳定转染步骤

1.G418的配制：方案一：300mgG418加入3ml PBS溶液，浓度为100mg/ml，完全溶解后，0.22um过滤，-20℃保存。

方案二：（1）配制1M HEPES：23.8g HEPES（缓冲能力更强）粉末溶于100ml ddH2O，10NNaOH（加量较多）调节pH至7.3，过滤除菌（较难过滤），4℃保存，终浓度为1mol/L。

（2）5g G418溶于10ml 1M HEPES（pH7.3），终浓度为500mg/ml，-20℃保存。

注：实验中采用方案二时效果较好。

2.制备筛选培养基：用培养基将G418稀释为0 ug/ml、200 ug/ml、300 ug/ml、400 ug/ml、500 ug/ml、600 ug/ml、700 ug/ml、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml24孔板，每孔1ml培养基（含有G418的完全培养基），每个浓度4个重复，则每次换液需各个浓度培养基4ml，现用现配。

200ug/ml300ug/ml400ug/ml500ug/ml600ug/ml700ug/ml800ug/ml900ug/ml10 00ug/ml1100 ug/ml1200 ug/ml3ml完全培养基998.4997.6996..2994.4993.6992..2990.4G418(500mg/ml)1.6ul2.4ul3.2ul4.0ul4.8ul5.6ul6.4ul7.2ul8.0ul8.8ul9.6ul3.细胞培养：将冻存的细胞复苏培养，，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板（200/孔），12h换液，加筛选培养基培养。

4.确定G418最佳筛选浓度：将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准。

注：实验中所确定的最佳筛选浓度为1200ug/ml。

G418筛选稳定表达细胞株精要总结

G418筛选稳定表达细胞系总结一分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。

外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。

极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。

细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。

由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。

一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。

细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。

G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。

是稳定转染最常用的选择试剂。

当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。

Ｇ418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。

其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。

但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。

我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。

因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。

HT22细胞的G418筛选

HT22的G418稳定筛选提供一点参考
根据制造商的指示pcDNA3-cMyc-mCRHR1被用来使用脂质体试剂转染HT22细胞。

目的是稳定表达细胞系CRHR1(HT22-CRHR1)，转染细胞在有G418 (800微克/毫升;生命技术)存在的DMEM(中生长以便选择转染的细胞。

G418幸存的克隆再次培养并保持在DMEM补充5%胎牛血清(FCS), 4mM谷酰胺, 10 mM HEPES,2.2毫克/毫升NaHCO3,100 U /毫升青霉素,100毫克/毫升链霉素(技术),和200 ug / ml G418，在37°C湿润5%二氧化碳培养箱。

CRHR1稳定转染细胞系中的表达水平使用鼠标单克隆抗c-Myc-antibody(1:1000稀释)进行免疫印迹。

13个阳性HT22-CRHR1克隆被获得。

所有的实验都至少执行2 次2个不同表达水平的c-Myc-CRHR1的单独克隆(克隆2和3)。

稳定表达蛋白的细胞系筛选方法

稳定表达蛋白的细胞系筛选方法实验目的建立可稳定表达蛋白的细胞系。

实验原理外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，最终整合进细胞染色体。

由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。

一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。

细菌Tn5转座子序列（Neo抗性基因）携带的氨基糖苷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。

G418是一种氨基糖类抗生素，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性。

是稳定转染最常用的选择试剂。

当 neo 基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能动neo 基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。

G418筛选预实验：由于各真核细胞系对G418 敏感度不同，各新细胞系或株稳定转染时杀死非稳定转染细胞所需用量需要通过实验优化。

最适用量通过建立细胞死亡曲线获得。

将细胞稀释至1000 cell/mL，每孔100 ul 加入有培养基的24 孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100 ug/mL等12个级别，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-800 ug/mL左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半即可。

操作步骤1. 质粒转化及扩增按照常规操作步骤将质粒转化到感受态大肠杆菌DH5α中，挑取单个克隆质粒抽提，进行酶切测序验证无误后扩增细菌，抽提质粒备转染用。

2. 细胞转染及筛选将细胞接种于6孔板，约70％密度无血清无抗生素条件下，按照脂质体Lipofectmine 2000（Invitrogen）说明书中的剂量，使用质粒及脂质体进行转染，同时设空白对照。

6 h后改用含血清及抗生素的培养基（根据细胞密度添加血清），转染结束后24 h加G418进行筛选，以最低致死浓度筛选，根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。