药物分析--药物分析中的新技术新方法

从专业角度来讲， DNA 亲子鉴定是根据遗传学原理，运 用现代生物技术，对被鉴定者进行特定 DNA 片段的提取和 检测，并对结果进行相应的计算分析，得出鉴定结论的过程。
DNA亲子鉴定的主要方法： DNA是从几滴血，腮细胞或 培养的组织纤内提取而来。将 DNA 样本切成小段，放进喱 胶内,用电泳槽推动 DNA 小块使之分离 --最细的在最远，最 大的最近。之後，分离开的基因放在尼龙薄膜上，使用特别 的DNA 探针去寻找基因，相同的基因会凝聚于一块，然后， 利用特别的染料，在 X光的环境下，便显示由 DNA 探针凝聚 于一起的黑色条码。这种肉眼可见的条码很特别 ---- 一半与 母亲的吻合，一半与父亲的吻合。对该过程重复几次，每一 种探针用于寻找 DNA 的不同部位并影成独特的条码，用几 组不同的探针，可得到超过 99,9%的父系或然率或分辨率。
● 滴骨验亲法：滴骨验亲法就是将生者的血液滴在 死人的骨骸上，若血液能渗透入骨则断定生者与死者 有血源关系，否则就没有。这种方法并不科学，但开 创了用血型鉴别血源关系的先河。
● 滴血验亲法：滴血验亲法又称合血验亲法，就是 将小孩的血与大人的血液放在一起，如果能融在一起， 就是父母亲生的，否则就不是亲生的。这种方法没有 科学依据，亲子关系的血液不一定能融合，而非亲子 关系的血倒有可能融合。
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含离子的液滴
随液滴蒸发， 电场加强，离 子向表面移动
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离子从表面蒸发
离子蒸发机理：
（2）APCI （大气压化学离子化） 最软的电离方式之一
? 特点： 一般只给出化合物的分子量信息，通过 源内 CID （碰撞诱导分解）可同时获得 结构信息。
1. 毛细管区带电泳：
（capillary zone eletrophoresis, CZE ）
是最基本、最常用的分离模式。
适用于所有具有不同淌度的荷 电粒子的分离，但不能分离中性 物质及质荷比相同的组分。
2. 胶束电动毛细管色谱：
（micellar eletrokinetic capillary chromatography, MECC ）
青霉素发酵液的高效毛细管电泳图： 1. 青霉素G钠 ；2. 6-APA ；3. 对羟基苯乙酸 ；
4. 邻羟基苯乙酸 ；5. 苯乙酸
2. 中药成分分析 如：黄酮及其甙类分析
黄芩中6种黄酮类成分的胶束电动毛细管色谱分离图： 1.汉黄芩甙；2. 黄芩素；3.黄芩甙；4. 千层子素；5. 汉黄芩素；
6.内标水杨酸；7.白杨素
在分子生物学和蛋白质化学上有着 十分广泛的应用。
4. 毛细管等电聚焦电泳：
（capillary isoelectric focusing, CIEF ）
根据蛋白质的等电点不同而进行分离。
AB ED
B A
C
FD
E
B AE
AC D
B
E D
B
F A
CA
C EB D
AA BB AA BB
低
CC DD
EE
FF
2．溶解细胞核内的 DNA 在浓度较高的 NaCl 溶液中核蛋白容易解聚，游离出
的DNA 溶解在溶液中。在溶液中加入两倍体积的浓度 为2 mol/L 的NaCl溶液，搅拌 1min。注意应沿一个方 向搅拌，使DNA 充分溶解。
3．DNA 的析出 将溶液中的 DNA 与其他杂质分离，这一步骤是关键。
（一）基本原理：
v = veo+ vep = (μeo+μep) ·E
veo:电渗流速度； μeo: 电渗流淌度 vep:电泳流速度；μep: 电泳流淌度 E：电场强度； v: 迁移速度
(－)
－+－++－+－++－+－+－+－+
+
+ +
+ +－++－++－+－+－+－++－+－+－－
(+)
电渗产生示意图：
● DNA鉴定：目前用得最多的鉴定亲子关系方法是 DNA 分型鉴定。人的血液、毛发、唾液、口腔细胞及 骨头等都可以用于亲子鉴定。一个人有 23对（46条） 染色体，同一对染色体同一位置上的一对基因称为等 位基因，一般一个来自父亲，一个来自母亲。如果检 测到某个 DNA 位点的等位基因，一个与母亲相同，另 一个就应与父亲相同，否则就存在疑问了。利用 DNA 进行亲子鉴定，只要作十几至几十个 DNA 位点的检测， 如果全部一样，就可以确定亲子关系，如果有 3 个 以 上的位点不同，则可排除亲子关系，有一至两个位点 不 同 ，则应考虑基因突变的可能，加做一些位点的检 测进行辨别。 DNA亲子鉴定，否定亲子关系的准确率 几近100%，肯定亲子关系的准确率可达到 99.99%。
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+ +
+ + +
(－)
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+ + +
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毛细电泳中不同组分的迁移示意图：
10
（二）主要分离模式： 1. 毛细管区带电泳（ CZE ）； 2. 胶束电动毛细管色谱 （MECC ）； 3. 毛细管凝胶电泳（ CGE ）； 4. 毛细管等电聚焦电泳 （CIEF ）；
? 优点：
通常只给出分子离子峰（或准分子离子 峰）。
? 适用化合物：
蛋白质、多肽、寡核苷酸等生物大分子。
5、API（大气压离子化） 软电离技术
（1）ESI（电喷雾离子化） ? 特点：
能够产生多电荷离子。 ? 适用化合物：
对生物大分子及其他分子量大的 化合物的分析较有利。
毛细管 + 4kV
+ －
－ +
检测器
数
据
处
毛细管恒温系统
理 系
毛 细
高压电源
统
管
（+） 缓冲液/样品
(－) 缓冲液
毛细管电泳装置示意图
在柱检测器
HPCE 是经典电泳技术与现代微柱分离相结合 的一种快速、高效的液相分离技术。具有以下特点：
1. 高效率：柱子长，故理论塔板数大。 2. 高灵敏度： CE 分离后一般用激光诱导荧光检 测法（ LIF ）或安培电化学检测法（ EC ），可检测 到10-19mol/L ，甚至到单细胞检测。 2. 高速：做一个样只需几十秒到几十分钟。 3. 微量：进样 1? L即可。 4. 低成本： 5. 易于自动化：
+
+
+
+
二次离子束
+
快原子枪
样品靶
快原子轰击质谱示意图 :
FAB的特点：
? 优点： 样品不须汽化；既给出化合物的分子 量信息，又给出结构信息。 适用范围广，仪 器商品化较早，普及率高。
? 缺点： 重现性差，灵敏度较EI 低。 ? 适用化合物：
极性、高分子量、非挥发性及热不稳定化合物。
4、MALDI（基质辅助激光解吸离子化） 软电离技术
DNA的纯化还有许多其他方法。例如，添加 质量分数为 25％的十二烷基磺酸钠 (SDS) 溶液， 使蛋白质变性后与 DNA 分开。随后，加入氯 仿—异丙醇混合液（体积比为24∶1），通过离 心将蛋白质及其他杂质除去 ,取上清液。可重复 上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液 体。此外苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核 酸酶的活性。利用苯酚处理后，离心分层， DNA溶于上层水相，蛋白质变性存在于酚层中， 这时可用分液漏斗或吸管等仪器将二者分开。
DNA鉴定的具体步骤： 1.破碎细胞，释放DNA
血中的 DNA 与核蛋白结合，位于血细胞的 细胞核中，正常情况下是不会释放出来的。为 了使DNA 从细胞核中释放出来，需要向血细胞 液中加入蒸馏水，并且搅拌，从而使血细胞膜 和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破 裂。一般5～10 mL 的血细胞液加入 20 mL 蒸 馏水搅拌5 min。释放出来的大量DNA 和RNA 往往与蛋白质结合在一起，应用 3～4层纱布进 行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。
4.DNA的初步纯化 如果提取的DNA 量不够多且其中含有较多杂质， 会使制取的 DNA 粗制品不能显示出 DNA 的本色 ──白色。需要对 DNA 粗制品进行简单的提纯， 将DNA 黏稠物再溶解，继续用 2mol/L 的NaCl 溶液20mL 溶解DNA 黏稠物，仍旧沿一个方向不 停搅拌 3 min ，使DNA 充分溶解，以免损失。 用 3 ～ 4 层纱布进行过滤（或离心），滤去杂质， 收集含有 DNA的滤液。向滤液中贴壁缓慢加入 50mL 预冷的体积分数为95％的乙醇，并用玻璃 棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌，溶液中会出现 DNA 丝状物。
? 缺点：
样品须汽化后才可离子化
? 适用化合物：
易挥发、热稳定化合物。
2、CI（化学离子化） 软电离技术
? 优点： 可以得到较强的准分子离子峰，有利 于分子量的测定。
? 缺点： 样品须汽化后才可离子化。
? 适用化合物： 易挥发、热稳定化合物 。
3、FAB（快原子轰击离子化） 软电离技术：
质量分析器 原子束
第三节：亲子鉴定方法
亲子鉴定就是利用 医学 、生物 学和遗传学 的理论和技术，从子代 和亲代的形态构造或生理机能方面 的相似特点，分析 遗传特征，判断 父母与子女之间是否是亲生关系。
原始的亲子鉴定方法
● 外貌对比法：通过外貌长相的对比来确定亲子关 系恐怕是最原始的方法，但这样方法只是一种猜测、 判断，作为一种参考。
现代的亲子鉴定方法
● 血型测试： 血型测试进行亲子鉴定就是通过对血 型的检验比对来确亲子关系。依据 19世纪末被公认的 孟德尔遗传定律 ，人们认识到人类的血型是按照遗传 基因传为下一代，故一定血型的父母所生子女也具有 相应的血型，这为血型鉴定亲子关系奠定了基础。
● 染色体多态性鉴定： 20 世纪 80 年代，医学家们 又开创了使用 染色体 多态性鉴定亲子关系的技术，染 色体多态性又称异态性（ heteromorphism) ，是指 正常人群中常见的各种染色体形态的微小变异（如： 随体增大、重复或缺如，着比粒区的荧光强度变异 等），这种多态是可以遗传的。这项技术就是利用其 形态来鉴定亲子关系，这要靠技术人员的主观判断， 其准确率也不尽如人意。
用离子胶束溶液代替简单的缓冲溶 液，使中性组分可按其疏水性的不 同及在两相间的分配系数的不同而 分离。采用手性分配相，可用于手 性化合物的分离。
3. 毛细管凝胶电泳：
（capillary gel eletrophoresis, CZE ）
凝胶的网络结构对溶质具有分子筛 的作用，可分离质荷比相同但分子 大小不同的组分。
药物分析中的新技术、 新方法
第一节
高效毛细管电泳 （HPCE）
毛细管电泳（ Capillary Electrophoresis,
CE ）也称高效毛细管电泳（ HPCE ）或毛细管 电分离法（ CESM ），是一种以毛细管为分离 通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分 离分析技术。由于CE 可以分离从离子到中性分 子；从小分子到生物大分子的一系列化合物， 尤其是以生物工程为代表的生命科学领域中的 多肽、蛋白质、 DNA的分离。因此， CE 被认 为是当代分析科学中最具活力的前沿研究领域。
加蒸馏水降低 NaCl 溶液浓度，使 DNA 析出。注意加水 太多、溶液过稀，会使 DNA 分子又重新溶解。
用3～4的层纱布对 DNA稀释液进行过滤，滤去蛋白 质，收集 DNA 的黏稠物。如果采用离心法，效果更好。 用4000 r/min 转速的离心机，离心 15min ，除去上清 液 (含有蛋白质 )，留下的沉淀物中含有 DNA 。此时注 意观察DNA 黏稠物的颜色。
? 适用化合物： 与ESI 比较，更适于分析极性及分子量 小（＜1000 amu ）的化合物。
雾化气 样品
+ 溶剂
反应气等 离子体
真空
加热管
Corona 放电
电极
APCI电离原理：
二、质量分析器及质量分离原理 1、扇型磁场质谱仪。 2、四极质谱仪。 3、飞行时间质谱仪。 4、离子阱质谱仪。
亲子鉴定
第二节：质谱法及其应用
真空系统
进样系统
离子源
质量分析器
控制和数据 处理系统
检测器
一、离子源及离子化技术
1、EI （电子轰击离子化）
阴极
试样蒸汽
电子束
离子
x
阳极
y V
z
加速电压
电子轰击质谱示意图：
? 优点：
灵敏度高，有丰富的碎片离子信息和成 熟的离子开裂理论，是结构分析、鉴定的 有力手段；重现性好，有标准图谱，可以 通过谱库检索对未知物进行结构鉴定。
CC DD
EE
FF
pH 梯度
高
分离模式小结：
模式 缓冲液体系
CZE 自由缓冲液
毛细管区带电泳
胶束－缓冲溶
MECC
胶束动电毛细管色谱
液
凝胶－缓冲溶
CGE
毛细管凝胶电泳
液
CIEF 两性电解质
毛细管等电聚焦
分离机理
离子淌度 疏水性/离子性
相互作用 分子大小和 荷电数目
等电点
应用：
1. 监测药物生产过程 如：监测青霉素发酵液中有关 物质的量。