郭丹钊-江苏大学-桑黄菌丝体活性物质的超声波辅助提取工艺研究

桑黄菌丝体活性物质的超声波辅助提取工艺研究
郭丹钊1马海乐曹颖王文秀王亚王薇薇
（江苏大学食品与生物工程学院镇江212013）
摘要目的：本文采用超声波辅助技术提取珍惜食药用菌桑黄菌丝的活性物质。

方法：设置超声波功率、料液比、提取温度及提取时间等四个因素，提取其主要活性物质多糖和三萜化合物，得到超声波辅助提取的最佳条件。

结果：多糖提取条件为：提取功率120 W、料液比1:40（g/ml）、提取温度45 ℃、提取时间30 min，该条件下桑黄菌丝多糖提取量可达107.324 mg/g；三萜化合物提取条件为：超声功率150 W、料液比1:50（g/ml）、提取温度45 ℃、提取时间25 min，该条件下三萜提取量为15.102 mg/g。

结论：本研究结果表明采用超声波辅助技术可显著提高桑黄菌丝活性物质的提取效果。

关键词桑黄；菌丝体；超声波；多糖；三萜化合物
桑黄（Phellinus igniarius），又名桑黄菇、桑臣、桑耳、桑臣、胡孙眼，属层孔菌属、多孔菌科、多孔菌目、担子纲，因其是目前国际公认的生物治癌领域中效果最好的珍稀食用菌而备受关注[1]。

桑黄子实体含有丰富的多糖和三萜类化合物等重要功效成分，具有显著的抗氧化、抑制肝纤维化、抗血管生成和降血糖等多种生理功效[2]。

超声波辅助提取技术利用超声波产生的振动、空化、搅拌、粉碎等综合效应，破坏细胞壁，增加溶剂的穿透力，加速细胞内有效成分向溶剂溶解，从而可提高产物提取率，缩减提取时间[3-4]。

因其具有快速、经济、安全、高效等特点而被广泛用于多种生物活性物质的提取[5-8]。

本文针对桑黄的两种主要功能性成分多糖和三萜化合物，以桑黄菌丝为原料，采用超声波处理进行辅助
1郭丹钊，女，1978年生，博士，副教授，国家自然科学基金“弱磁场辅助桑黄液体发酵的响应规律及其磁效应机制研究（31301544）”资助。

提取，探索超声波辅助提取桑黄多糖和三萜化合物等代表性功效成分的最佳工艺条件。

1 材料与方法
1.1 试验材料
菌种：桑黄（Phellinus igniarius）菌种，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为5.0095。

材料与试剂：桑黄菌丝粉（桑黄菌种液体发酵后收集菌丝并冷冻干燥后获得），浓硫酸，苯酚，蒸馏水，葡萄糖，乙醇，冰醋酸，香草醛，高氯酸，齐墩果酸。

以上试剂均为国产分析纯。

仪器设备：KQ-300DE超声波清洗仪，L-500台式低速自动平衡离心机，L-1850R台式高速冷冻离心机，UV-1081紫外可见分光光度计，恒温水浴锅。

1.2 试验方法
1.2.1 多糖的提取[9]
称取桑黄菌丝粉0.1 g，并加入一定量的水进行超声波处理，离心取其上清液，加入等体积的无水乙醇4 ℃静置过夜，离心收集沉淀，并溶解于20 ml蒸馏水中，从其中取0.5 ml稀释至2 ml，即得待测多糖溶液。

按方法1.2.3测定样品吸光值。

1.2.2 多糖提取工艺优化
设置不同的超声功率、料液比、提取温度、提取时间等条件，研究其对桑黄菌丝多糖提取量的影响。

根据单因素试验结果，采用L9（34）的正交实验设计，进一步优化提取工艺参数，因素与水平设置见表1。

表1 多糖提取工艺正交实验设计表
Table 1 Design of polysaccharide orthogonal experiment
因素
水平 A B C D
超声功率（W）料液比（g/ml）提取温度（℃）提取时间（min）
1 120 1：30 45 25
2 150 1：40 50 30
3 180 1：50 55 35
1.2.3 多糖标准曲线测定[10]
精确称取葡萄糖100 mg，用蒸馏水溶解定容至100 ml，得到1 mg/mL的葡萄糖标准储备溶液。

再吸取储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 ml分别定容至50 ml容量瓶中，得到10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0mg/L的标准葡萄糖溶液，以上浓度溶液各取2 ml于试管中，并向其中加入新鲜配制的5 %苯酚溶液1 ml，混匀后再加入5 ml浓硫酸振荡混匀，置于沸水浴中加热20 min 后冰水冷却至室温，在490 nm处测量吸光值。

1.2.4 三萜化合物的提取[11]
称取桑黄菌丝粉0.1 g并加入一定量的无水乙醇，进行超声波处理，离心后取上清液200μl于试管中，并于60 ℃烘干，接下来按照方法1.2.6测得样品吸光值。

1.2.5 三萜化合物提取工艺的优化
设置不同的超声功率、料液比、提取温度、提取时间等条件，研究其对桑黄菌丝三萜化合物提取量的影响。

同样根据单因素试验结果，采用L9（34）的正交实验设计，进一步优化提取工艺参数，因素与水平设置见表2。

表2 三萜化合物正交实验设计表
Table 2 Design of triterpenoids orthogonal experiment
因素
水平 A B C D
提取功率（W）料液比（g/ml）提取温度（℃）提取时间（min）
1 150 1：30 45 15
2 180 1：40 50 20
3 210 1：50 55 25
1.2.6三萜化合物标准曲线测定[12]
分别精确称取齐墩果酸标准品0 mg，0.02 mg，0.04 mg，0.06 mg，0.08 mg，0.1 mg，0.12 mg，0.14 mg，0.16 mg和0.18 mg加入试管中，于60℃烘干，再向
上述烘干的试管中加入0.3 ml 新鲜配制的5 %香草醛-冰醋酸溶液混匀，然后加入1 ml 高氯酸溶液振荡混匀，在60 ℃水浴锅中保温20 min ，冷却至室温后加入10 ml 冰醋酸，振荡摇匀，于548nm 处测量吸光度值。

2 结果与讨论 2.1 超声功率的影响
料液比为1:40（g/ml ），提取温度为60 ℃，提取时间为30 min ，设置超声功率分别为0 W ，120 W ，180 W ，240 W 和300 W ，测定并计算菌丝多糖提取量；料液比为1:40（g/ml ），提取温度为50 ℃，提取时间为30 min ，设置超声功率为0 W ，120 W ，180 W ，240 W 和300 W ，测定并计算菌丝三萜化合物的提取量。

图1 超声功率对多糖及三萜化合物提取的影响
Fig.1 Effect of ultrasonic power on extraction of polysaccharide and triterpenoids
试验结果显示，超声波处理有利于樟芝菌丝体多糖和三萜化合物的提取，处理组两种功效成分的提取量均高于不施加超声波处理的对照组，随着超声功率的增大，两种功效成分的提取量不再显著增加。

当功率高于120 W 时多糖的提取量逐渐呈下降趋势（图1A ），可能是由于过高的超声波功率引起了多糖分子结构的破坏，从而造成了多糖的部分损失。

对于三萜化合物，随着超声功率的增大其提取量也在逐渐增加，当功率大于180 W 时，提取量则不再增加，但在试验功率范围内未引起提取量呈现下降趋势（图1B ），可能是由于三萜化合物属于小分子化合物，供试范围内的功率不足以引起其结构的破坏。

因此，分别选择120 W 和180 W 作为多糖和三萜化合物的后续工艺研究的提取功率。

2.2 料液比的影响
超声功率为120 W ，提取温度为60 ℃，提取时间为30 min 的条件下，设置料液比为1:20，1:40，1:60和1:80（g/ml ），测定并计算菌丝多糖提取量；超声
超声功率（W ）
多糖提取量（m g /g ）
超声功率（W ）
三萜提取量（m g /g ）
功率为180 W ，提取温度为50 ℃，提取时间为30 min ，设置料液比为1:20，1:40，1:60，1:80和1:100（g/ml ），测定并计算菌丝三萜化合物的提取量。

结果显示，料液比为1:40时多糖的提取量较高，随提取溶剂添加量的增加，多糖提取量的增加不再显著（图2A ），考虑到溶剂添加量过大会引起后续溶剂使用量的增加，选择1:40（g/ml ）作为最佳料液比。

随着提取溶剂比例的增加，三萜化合物提取量也呈现相似的趋势（图2B ），因此以料液比同样以1:40（g/ml ）作为最佳料液比。

图2 料液比对多糖及三萜化合物提取的影响
Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction of polysaccharide and triterpenoids
2.3 提取温度的影响
超声功率为120 W ，料液比为1:40（g/ml ），超声时间为30 min ，提取温度分别设置为40 ℃，50 ℃，60 ℃和70 ℃，测定多糖提取量；超声功率为180 W ，料液比为1:40（g/ml ），提取时间为20 min ，分别测定提取温度为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃条件下的三萜化合物的提取量。

结果显示出温度对多糖和三萜化合物的提取有较大影响。

50 ℃和40 ℃分别为多糖和三萜化合物的最佳提取温度（图3A 和3B ），随着温度的不断提高，两种功效成分的提取量均不再进一步提高，其中多糖的提取量甚至有大幅度降低，可能是高温对多糖结构产生影响而引起产量损失。

固液比
多糖提取量（m g /g ）
固液比
三萜提取量（m g /g ）
提取温度（℃）
多糖提取量（m g /g ）
提取温度（℃）
三萜提取量（m g /g ）
图3 温度对多糖及三萜化合物提取的影响
Fig.3 Effect of temperature on the extraction of polysaccharide and triterpenoids
2.4 提取时间的影响
超声功率为120W ，料液比为1:40（g/ml ），提取温度为50 ℃，分别测定提取时间为10 min ，20 min ，30 min ，40 min 和50 min 条件下的多糖提取量；超声功率为180 W ，料液比为1:40（g/ml ），提取温度为40℃，分别提取10 min ，20 min ，30 min ，40 min 和50 min ，并测定三萜化合物的提取量。

超声波处理可破坏细胞壁从而促进细胞功效成分的溶解和释放，因此处理时间对于提取结果有着较大影响。

由图4可知，在一定范围内延长提取时间，可显著提高多糖和三萜化合物的提取量，但时间过长则可引起两者提取量的降低，尤其是多糖提取量，推测可能是由于超声处理过久引起分子结构破坏，从而造成提取量的损失。

因此，分别选择30 min 和20 min 作为多糖和三萜化合物后续工艺优化的提取时间。

图4 提取时间对多糖和三萜化合物提取量的影响
Fig.4 Effect of time on the extraction of polysaccharide and triterpenoids
2.5 正交试验结果
根据单因素试验的结果，选取超声功率，料液比，提取温度和提取时间为测试因素，分别对多糖和三萜化合物的提取工艺进行L 9（34）的正交试验。

结果显示，各因素对桑黄菌丝多糖提取的贡献程度依次为：超声功率>料液比>超声时间>超声温度，并得出最优的参数组合为超声功率120 W ，料液比1:40（g/ml ），提取时间30 min ，提取温度45 ℃（表3）；而各因素对桑黄菌丝三萜化合物的提取影响程度依次为超声功率>提取时间>提取温度>料液比，且参数的最佳组合为超声功率150W 、料液比1:50（g/ml ）、提取温度45℃、提取时间25min （表4）。

提取时间（min ）多糖提取量（m g /g ）
提取时间（min ）
三萜提取量（m g /g ）
经验证试验，在以上得出的最佳工艺参数条件下，桑黄菌丝多糖和三萜化合物的提取量可分别达到107.324 mg/g 和15.102 mg/g ，表明选择的最佳提取工艺可行。

表3 多糖正交实验数据
Table 3 Orthogonal experimental data of polysaccharide
表4 三萜化合物正交实验数据
Table 4 Orthogonal experimental data of triterpenoids
试验号 因素
提取量（mg/g ）
A B C D 1 1 1 1 1 105.325 2 1 2 2 2 110.736 3 1 3 3 3 96.281 4 2 1 2 3 85.365 5 2 2 3 1 83.937 6 2 3 1 2 85.103 7 3 1 3 2 93.625 8 3 2 1 3 90.284 9 3 3 2 1 79.115
K1 312.342 284.315 280.712 280.712 K2 254.405 289.726 275.216 289.464 K3 263.024 260.499 273.843 271.930 k1 104.114 94.772 93.571 93.571 k2 84.802 96.575 91.739 96.488 k3 87.675 86.833 91.281 90.643 R 19.312
9.742
2.290
5.845
主次顺序 ABDC
最优因素 A1
B2
C1
D2
最优组合
A1B2C1D2
试验号 因素
提取量（mg/g ）
A B C D 1 1 1 1 1 14.801 2 1 2 2 2 11.354 3 1 3 3 3 15.648 4 2 1 2 3 11.790 5 2 2 3 1 11.012 6
2
3
1
2
9.891
7 3 1 3 2 8.739
8 3 2 1 3 12.009
9 3 3 2 1 10.358
K1 41.803 35.330 36.701 36.171
K2 32.693 34.375 33.502 29.984
K3 31.106 35.897 35.399 39.447
k1 13.934 11.777 12.234 12.057
k2 10.898 11.458 11.167 9.995
k3 10.369 11.966 11.799 13.149
R 3.565 0.538 1.067 3.154
主次顺序ADCB
最优因素A1 B3 C1 D3
最优组合A1B3C1D3
3 结论
通过单因素试验和正交试验确定了超声波辅助提取桑黄菌丝多糖和三萜化合物的最佳工艺条件，多糖提取条件为超声功率120 W，料液比1:40（g/ml），提取时间30 min，提取温度45 ℃；三萜化合物的提取条件为超声功率150W、料液比1:50（g/ml）、提取温度45℃、提取时间25min。

采用以上提取条件，菌丝多糖和三萜化合物的提取量分别达到107.324 mg/g和15.102 mg/g。

根据本文的研究结果，超声波辅助提取工艺大大提高了多糖和三萜化合物等药用食用真菌典型功能性成分的提取效率和提取量，与常规提取方法相比，避免了长时间高温处理对功能性成分的破坏，是一种可以考虑的具有快速、低能耗等优点的药用食用菌活性物质提取方式，为今后的进一步研究和应用提供参考。

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Study on ultrasonic wave-assisted extraction of active substances from Phellinus
igniarius
Danzhao Guo Haile Ma Ying Cao Wenxiu Wang Ya Wang Weiwei Wang （School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang
212013）
Abstract Objective: In this paper, ultrasonic wave-assisted technology was used in extraction process to improve the yield of biological active substances from mycelium of Phellinus igniarius. Method: Four test factors of Solid-to-liquid ratio, ultrasonic power, extraction temperature and extraction time were studied in extraction of polysaccharide and triterpenoids from Phellinus igniarius. Result: The results showed
that the optimal extraction condition for polysaccharide was ultrasonic power of 120W, solid-to-liquid ratio of 1:40(g/ml), extraction temperature of 45 ℃, extraction time of 30 min (with extraction yield of 107.324 mg/g under this condition), and the optimal extraction condition for triterpenoids was ultrasonic power of 150W, solid-to-liquid ratio of 1:50(g/ml), extraction temperature of 45 ℃, extraction time of 25 min (with extraction yield of 15.102 mg/g under this condition). Conclusion: The data indicated that ultrasonic wave-assisted technology could improve extraction yield of active substances from mycelium of Phellinus igniarius.
Key words Phellinus igniarius Mycelium Ultrasonic wave Polysaccharides Triterpenoids。