放射性核素在化学中的应用示踪原子方法原理利用

第十三章 放射性核素在化学中的应用
第一节 示踪原子方法原理
利用放射性核素容易探测这一优点，人们常用放射性同位素作为示踪来揭示体系中所研究物质变化的规律。

在一些简单的示踪方法中，放射性核素仅仅附着于所研究的对象上。

例如将含放射性钴的线系在昆虫身上，就可以利用γ射线来考察昆虫的活动习性和规律。

用放射性浮标可以测定密闭容器中的液面高度，此时，只要在液面上加有含少许放射性物质的浮标，便可根据探测到的射线来判断液面的高度。

在另一类应用中，由于放射性示踪与研究对象混合均匀，所以可以根据示踪的浓度判断研究对象的行为。

例如当油管中相继流过几中不同的油时，将可溶性的124Sb —三苯基锑加入油中，可以判断各种油流动时的交界面。

将24Na 标记的盐水溶液注入病人体内，待盐水在体内均匀分布后，取样分析24Na 的浓度可求得病人体液的总量。

在化学研究中，广泛用放射性核素作为示踪原子。

示踪原子方法常用于分子结构的研究；化学反应以及吸附、色层、电解、电泳等过程的动力学研究；还用于反应的平衡常数、活化能、分离系数、扩散速度、物质的比表面、溶解度、蒸气压等物理化学数据的测定；在分析化学中用于元素含量的定量测定等。

在化学中，除了将放射性同位素作为示踪原子应用以外，还可以作为辐射源应用。

后一类属于辐射化学领域。

本世纪初有人曾试图将RaD(210Pb)从大量珠铅中分离出来，然而实验表明，这种分离是徒劳的。

但是分离工作的失败却启示了人们，既然RaD 不能从铅中分离出来，RaD 和普通铅又发生完全相同的化学变化，那么就可以用RaD 来“标记”非放射性铅。

在可以忽略同位素效应的前提下，同一元素的各种同位素的物理化学性质完全相同。

因此若合成一种与所研究的化合物相同并含有放射性同位素标记化合物，则在将标记化合物均匀地加入所研究的化合物后，便可依靠对射线测量而方便地根据放射性同位素的行为来判断原来不易或不能辨认的大量稳定同位素的行为。

该放射性同位素的原子常称为示踪原子。

放射性示踪原子方法的原理可以用下式表示
→)(*A xAy S M →N →…. →Y →)''(A Ay x Z
→)(*A xAy S M’→N’→…. →Y’ →'Z (13--1)
→)(*A xAy S M →N →…. →Y’’ → ''Z 式中)(*A xAy S 表示开始时体系中化合物S 含有x 个稳定同位素原子A 和y 个放射性同位素原子*A ，在通常情况下，x 远远比y 大得多。

（13--1）式表示S 同时发生了三种化学变化，并且每一种化学变化又经过了一系列中间产物。

但是因为A 和*A 的化学性质完全同，所以无论是中间产物还是最终产物中，稳定同位素原子A 和放射性同位素原子*A 的数目之比总是等于x/y 。

例如对最终产物之一Z ，有y
x y x =''。

如果某一中间产物含有x’’个稳定同
位素原子A和y’’个放射性同位素原子*
A，则
y
x
y
x
''
''。

这样，人们只要观测
*
A的化学变化，
就可以断定A发生了同样的化学变化。

在此，*
A起到了示踪原子的作用。

以上所述A和*
A的化学性质完全相同，即忽略了同一元素的不同同位素效应。

对于中
等原子量的元素及重元素，完全可以忽略同位素效应。

但是对于像氢和碳这样的轻元素，就不能认为它们的各种同位素的化学性质相同，需要考虑同位素效应（见第三章）。

在示踪原子的应用中，除须忽略同位素效应以外，还必须忽略辐射引起的化合物的分解等作用。

在通常的化学实验中，忽略辐射化学作用是完全可以做到的，因为所用的放射性核素的量非常小。

但是在生物化学研究中，则由于所研究对象对辐射的作用特别灵敏，所以必须认真考察辐射化学作用。

例如将每毫升含8-10毫居里14C的甲醛放在某一密闭容器中，就会产生几个大气压的压力，这主要是甲醛受辐射分解产生H2和CH4等气体造成的。

由式（13-1）可见，示踪原子方法又一个十分重要的前提是A和*
A必须处于同一个化
学状态。

如果不能满足这一前提，必然会得到错误的结论。

已知的一千几百种放射性核素中，绝大多数不能用做示踪原子。

选择放射性示踪原子时，必须考虑下列因素。

一.半衰期
考虑到使用前核素的运输及储存、化学实验操作及放射性测量需要一定时间，选择示踪原子的核素必须有足够长的半衰期。

如果半衰期太短，衰变过于迅速，将使样品的放射性活度变化太大，难以得到准确的测量结果。

例如半衰期仅为实验所需时间十分之一的核素，在实验结束时，实际上几乎衰变完了。

因此只能在一些简单的实验中。

才可用寿命短的同位素示踪原子。

然而核素的半衰期也不宜太长，否则难以制备放射性比活度高的样品，并且由于放射性核素会在人体中储积，顺而一般说来半衰期越长的核素，放射性毒性越大，废物也越难处理，因此寿命太长的放射性核素不够理想。

目前用作示踪原子的放射性核素的半衰期一般在几小时到几千年之间，最常用的是半衰期在几星期至几个月之间的放射性核素。

二.射线的类型和能量
由于α射线的穿透能力很小又难以探测，因此α射线发射体除极少数以外，一般不用作示踪原子。

将β和γ发射体比较，应优先考虑β发射体。

这是因为γ射线的测量效率较低，就要求其用量较多；且它的穿透能力很大，对防护的要求就高。

当然，在有些实验中，正是利用了γ射线的穿透能力大，才使在厚层物质外的测量成为可能。

β射线探测效率高，易于防护。

在实验中当然最好用硬β射线发射体，如32P（Ep=1.71MeV）。

如果β射线的最大能量小于0.1MeV，就不能简单地用盖革-弥勒计数管，例如：3H（Ep=0.01861MeV）就必须用液体闪烁计数器来测量。

三.放射性核素的纯度
用作示踪原子的核素应具有高的放射性纯度、放射化学纯度和化学纯度，在制备放射性核素的过程中，如果靶子物不纯而含有杂质，即使杂质含量不高，也可能因为核反应截面很大而产生放射性杂质。

靶子核素发生的副反应是放射性杂质又一来源。

因此，为了提高示踪原子的核素的纯度，必须仔细控制辐照条件以及对靶子采用适当的方法加以提纯。

如果放射性核素发生α和β衰变，则在使用示踪原子前必须注意到放射性核素的子体是
否稳定性的。

如果子体也是放射性的，在测量放射性活度时，就需要考虑子体放射性对测量有多大影响。

便如90Sr(半衰期28.1年)的子体是稳定的子体是90Y （半衰期6.4小时），两者都是β—射线发射体，但β离子的能量不同，前者小，后者大，故90Y 的β衰变对90Sr 的测量有很大影响，若用已分离去90Y 的90Sr 作示踪原子，在短期内可不考虑90Y 的射线对测量的影响。

如果子体是稳定的核素，虽然子体不影响放射性纯度和放射化学纯度，但引进的子体核素杂质会影响化学纯度。

例如32P 经过14.3天后，有一半变成了32S 。

寿命短的母体核素对纯度的影响大。

此外，在放射性核素的储存过程中，也可能由于辐射分解和同位素交换反应而使纯度降低。

在选择示踪原子时，还应尽可能使用低毒性的放射性核素，以保证使用人的安全和周围的环境少受污染。

因此，当某一元素有几种放射性同位素时，必须根据以上选择原则选择示踪原子。

例如人们愿意用14C (半衰期5730年)，而不用11C （半衰期20分），因为14C 易于得到，11C 半衰期短；愿意用ThB （半衰期10.6小时），而不用RaD （半衰期22.3年）作为铅的示踪原子，因为RaD 发射软β射线（81％的β射线的最大能量为0.015MeV ）；在90Sr 、89Sr 和85Sr 三种同位素中，宁可用后两种，因为90Sr 的毒性最大。

至今还有一些元素还没有适合的放射性同位素可以作为示踪原子。

例如He 、Li 、B 没有半衰期超过一分钟的放射性同位素，Ne 、N 、O 、Mg 、Al 没有半衰期超过十分钟的放射性同位素，F 和Si （32Si 除外）没有半衰期大于三小时的放射性同位素。

对于这些元素就需要用稳定的同位素原子作示踪原子。

放射性示踪原子方法的优点之一是灵敏度高。

其原因是极其微量的放射性物质也能被准
确的测定，在适当的条件下，甚至可以探测和测定低达10－19克或更少的放射性核素，这是
可能只有几千个原子，因此只有利用原子示踪方法才可以测定某些难溶化合物的溶度积和难挥发化合物的蒸气压等，只有跟踪示踪原子的行迹才可研究给定元素在某些化学或生物化学过程中的运动规律，这些工作是无法用其他方法代替的。

放射性示踪原子方法的另一个优点是特效性强。

这是因为各种放射性核素的半衰期、射线类型和能量各不相同，这使得跟踪放射性原子的工作决不会模棱两可，更不会受非放射性物质的干扰。

因而放射性示踪原子特别适用于微量物质示踪、揭示某些物质运动变化规律的研究以及医学与生物学中研究体内的生理变化等。

示踪原子方法作为一种重要的科学研究手段正广泛用于化学反应和生物化学过程的研究，有力地推动了它们的发展。

在研究工作中要应用示踪原子方法，必须先获得某种放射性核素，并制备它的放射性比活度足够高的标记化合物，然后实验才能开始。

在实验中，放射性标记化合物由于稳定化合物相混合而受到一定程度的稀释，因此原始的标记化合物的放射性比活度必须足够高，才能在测量稀释后的样品时得到准确的测量结果。

不同的研究过程、实验方法和测量条件，要求有不同的放射性比活度，因此在实验前有必要估计一下需要多少示踪原子。

假定为了使测量误差在规定的范围之内，要求测量的样品的放射性时，每分钟计数为A 则实验所需要的示踪原子的毫居里数为q 为
60
107.3110010070⨯⨯⋅⋅⋅=ϕp V V A q 式中 V 0—所研究体系的体积（或质量）
V —所测样品的体积（或质量）
P—示踪原子进入所研究过程的百分数（％）
—核辐射探测器的计数效率（％）
在实验中或实验后，取样品测定其放射性计数时，一般采用相对测量法。

要注意的是测量应在同一条件下进行，即试样和标准应组成相近、厚度相同等，应该用同一计数器、在相同几何条件下测量，这样可消除自吸收、自屏蔽、反散射等因素引起的误差。

第二节化学反应机理的研究
示踪原子方法对确定化学机理作出了很大的贡献。

大多数化学反应是分好几步进行的，即在反应物与最终产物之间存在一系列中间产物。

用示踪原子不难发现这些中间产物并确定它们在反应中的先后次序。

尤其在生物化学中，反应历程往往很长，有时还是循环的，在这种情况下使用示踪原子就显得特别有效。

在有机化学和生物化学中，经常遇到复杂的大分子，研究大分子的合成过程，判断分子中原子或原子团在化学反应中的转移方向等，也少不了要用示踪原子，因而在有机化学和生物化学的研究中，示踪原子方法具有重要的意义，主要应用于以下几个方面：
一. 鉴别化学反应中有关的化合物
对一个给定的反应提出第一个问题是在反应历程中涉及到哪些物质。

示踪原子对解决这个问题是非常有用的。

例如，在14CO2参加的光合作用中，在植物见光的短时间内，可以从该植物中分离得到三十多种含14C的化合物。

看来可以认为，这些化合物都是由CO2开始的光合作用生成的。

一般说来，不可能由于同位素交换反应而使所得的化合物中含有14C。

与此相反的问题是最终产物的前身是什么。

例如研究尿酸的合成。

将用13C标记的有可能是哦尿酸的前身的各种化合物分别喂给鸽子吃，然后分析排泄物中的尿酸。

研究结果表明13C—碳酸盐，13C—甲酸盐，13C标记在羧基上的醋酸盐，13C标记在羧基和α,β 位上的乳酸盐，13C标记在羧基上的甘氨酸等都使得最终产物尿酸含有13C，显然它们都参加了尿酸得合成反应。

二.鉴别化学反应的中间产物
已知反应物和最终产物，研究可能的中间产物常是确定反应历程的最重要方法，有些中间产物只在瞬间形成，所以不能用普通的化学方法，而只能用示踪原子方法鉴别。

假设某反应的历程为
A→B→C
显然A是B的前身化合物，B是C的前身化合物，要检验该反应历程是否正确，首先在体系中加入用某放射性示踪原子标记A,并观察在B中是否有示踪原子的出现，其次是在另一实验中，加入用示踪原子标记的B，同样观察C中是否有示踪原子的出现。

在第一个实验中，如果向样品加入足够量的非放射性的B以载动示踪原子，实验将简便些。

第三个实验是观察加入非放射性B后，是否使生成的C的示踪原子量减小。

如果上述三个实验都得到否定的结果的话，那么B不可能是中间产物。

相反，如果得到的是肯定的结果，还不能断定B就是中间产物，有可能B与反应历程中的别的产物发生了同位素交换反应，因此还有必要进一步考察是否存在这种交换反应。

例如，在研究从铬酸盐溶液5电沉积铬的过程中Cr（Ш）是否为中间产物时，如果将51Cr标记在铬酸盐上，电沉积产物就具有放射性；相反，如果将51Cr标记在Cr（Ш）上，电沉积产物就没有放射性。

而且由在室温下Cr（Ш）与铬酸盐的同位素交换速度非常小这一事实，可以肯定Cr（Ш）不可能为该电沉积过程的中间产物。

十六烷C16H34在氧化铬—氧化锰催化剂的催化下会发裂化反应和芳香异构化反应而生成复杂的混合物。

若在反应体系中加入芳香基上有14C标记的甲苯，则发现只有极少量1，3，5—三甲基苯这样的芳香化合物带有放射性。

可见复杂最终产物不可能有甲苯作为中间产
物形成。

相反，如果加入的是14C 标记的丙稀，则包括芳香族化合物在内的几乎所有的产物都具有放射性。

由此可以说明。

每一种产物至少有一部分是由丙稀参加的反应形成的。

现研究N —氯乙酰苯胺在盐的作用下重排为对氯乙酰苯胺的反应： NClCOCH 3Cl NHCOCH 3
实验发现，当加入的盐酸为放射性示踪原子标记化合物时，能得到放射性产物。

这表明，上述重排反应不是分子内反应，而是重排时氯原子被释放出来，然后放射性氯可能发生亲电取代反应而生成放射性产物：
NClCOCH 3+HCl *NHCOCH 3+Cl ClH *+NHCOCH 3
Cl *+HCl
但是，N —氯乙酰苯胺与放射性的盐之间有可能缓慢地发生同位素交换反应，使示踪原子进入产物。

为了估计这种可能性，就要定量地确定这一交换反应速度。

研究结果表明，该交换反应非常慢以致无法计算由此产生了多少放射性产物。

因此可以得出结论，游离态地氯确实是上述重排反应地中间产物。

在生物化学中，葡萄糖厌氧发酵生成醋酸
C 6H 12O 6→3CH 3COOH
的过程中，发现有极少量的二氧化碳（碳酸根）生成。

如果非放射性的葡萄糖在含有14C 标记的碳酸根的介质中发酵，生成的醋酸的甲基及羧基上都有14C 。

同时还发现，碳酸根的浓度没有发生变化。

由此可以认为二氧化碳与醋酸发生同位素交换而进入产物。

但由于当发酵在14CH 3COOH 中进行时，没有发现有14CO 2生成，因此可以排除上述同位素交换反应。

从产物中14C 的含量可以推断，每个葡萄糖分子会产生两个二氧化碳分子，反应过程如下： C 6H 12O 6→2CH 2COOH+2CO 2
2CO 2→CH 3COOH
三. 研究反应中各中间产物的前后次序
在鉴别了某反应涉及到那些化合物后，接下来的一项工作是把这些化合物按照一定的反应历程先后排列起来。

其实，在鉴别这些中间产物的过程中，通常已搜集了大量的有关反应历程的信息，这些信息与化学反应的有关知识结合，在大多数情况下已足以确定反应历程的主要特征，最后再依靠动力学研究就可以完成这项工作。

例如，根据反应进程与时间的关系可以确定如下的反应次序：
碘化物→一碘酪氨酸→二碘酪氨酸→甲状腺素
将示踪原子注入动物体内后，在不同的时间能测到放射性比活度不同的三种有机化合物，最终到达定态条件后，三种化合物的比活度相同。

开始在短时间（约10分钟）内，一碘酪酸氨的放射性最强。

几小时以后，一碘酪酸氨与二碘酪酸氨的放射性比活度相同，但比甲状腺素强，直到2-3天后最终产物的放射性比活度才与前两个产物的相等。

根据上述观察
结果，显然可以得到如前所述的反应历程。

四. 确定化学键断裂的位置
在研究化合物的降解反应时，长靴要知道反映中化学键断裂的位置。

为此可以用示踪原子标记化合物，跟就示踪原子在产物中的位置判断化学键断裂的位置。

例如，并算氧化会生成一碳碎片和二碳碎片，断裂的化学键可能是键α-键，也可能是β-键：
为了解决这个问题，需要制备C 或14C 标记的4丙酸，但是标记化合物中的示踪原子的位置必须是确定无误的。

例如，用C 2H 5I 得到的Grignard 试剂C 2H 5MgI 与2*O C 反应，可得到标记在羧酸上的丙酸OOH C CH CH *23。

早期的研究工作是在酸性溶液中以重铬酸盐来氧化。

OOH C CH CH *23实验发现，反应生成了 非放射性的醋酸和放射性的二氧化碳，从而表明化学健在α-位断裂，故反应为：
OOH C CH CH *23→CH 3COOH ＋2*O C
后来研究OOH C CH CH *23或OOH C H C CH 2*
3发生反应，发现除了上述反应以外，还有副反应发生，丙酸上的三个碳原子都可以形成二氧化碳。

因而用重铬盐氧化并不是从丙酸上除去羧基的最理想方法。

在碱性溶液中，以高锰酸盐作氧化剂氧化丙酸时，生成的一碳碎片是碳酸盐，二碳碎片是草酸盐。

如果丙酸中示踪原子在羧基上，反应生成的草酸盐中约含90％示踪原子，碳酸盐中约含10％示踪原子。

由此可见，化学键断裂有90％在β—位上，有10％发生在α—位上。

但是在得出结论之前，还需要考虑另一种可能性，即化学建的断裂100％发生在β—位上，然后又在草酸盐与碳酸盐之间发生了同位素交换反应。

在同样的条件直接研究上述交换反应的结果表明，交换反应并不发生，因而可以排除由于同位素交换反应而使碳酸盐具有放射性的可能性。

在研究分子重排的机理时，也常用示踪原子方法。

例如研究阿脲重排成阿脲酸，随后氧化为班酸和二氧化碳的过程：
重排反应产物可能通过3，4—键断裂或4，5—键断裂形成。

在前一种情况下，新形成
3，5—键，4—碳原子形成CO 2。

当用5—碳原子为14C 的阿脉发生重排时，所有的放射性全部在仲班酸产物中。

由此可以得出结论,3,4—键比4，5—键容易断裂.
四. 研究大分子的形成过程
示踪原子方法对研究大分子的合成过程有重要意义，特别是在生物体系中，可以研究简单的小分子如何缩合形成复杂的大分子的骨架。

例如研究动物脂肪酸的形成过程，将14C 标记在CH 314COOH 注射的山羊体内后，分析羊乳脂肪样品，发现脂肪中的丁酸在羧基和β—碳原子上有等量的14C ，这表明丁酸是由两个标记醋酸分子缩合而成的。

COOH CH CH 21422142142CH COOH CH −→−
又发现己酸中的14C 原子间隔地出现在碳链上：
C O O H CH 14
221422142CH CH CH CH
可见己酸是由三个标记醋酸分子缩合而成的。

但实验发现，己酸中羧基上放射性要比次甲基上大好几倍，可见三个醋酸分子不可能同时缩合成己酸，而一定是含14C 的丁酸先生成，随后被非放射性的丁酸所稀释，最后才与第三个醋酸分子缩合。

实验证明，在含8个碳的酸中，14C 原子分布与预期的相同。

这一发现解释了自然界存在的脂肪酸总是有偶数个碳原子的原因。

胆固醇的生物合成过程比较复杂。

胆固醇含有72个碳原子。

用双标记化合物13CH 314COOH 技术，发现这27个碳原子分别来自于醋酸的甲基和羧基，其中甲基贡献15个碳原子，羧基贡献12个碳原子。

为了分清胆固醇骨架中哪些碳原子由甲基提供，哪些碳原子由羧基提供，分别用COOH H C 3*和OOH C H C *3合成两种标记胆固醇，然后使胆固醇降解。

实验结果如下所示，其中用圆圈标出的是由羧基供给的碳原子：
实验还发现，没有一个碳原子既是甲基供给，又有羧基供给。

对上述过程的进一步研究表明，如下所示的五碳结构的产物是胆固醇合成过程的中间体。

它是有三个醋酸分子缩合而成的六碳产物脱羧形成的。

然后六个五碳中间体相互连在一起，生成角鲨烯C 30H 50
最后角鲨烯失去三个甲基碳原子而环化生成胆固醇。

第三节 分配比和分离因数的测定
利用示踪原子测定液—液萃取或离子交换体系种某些元素在两相间的分配比是比较方便的，而不必采用复杂的分离合化学分析方法。

特别当被研究的是微量元素时，示踪原子方法更是几乎不可被其他方法所代替。

显然，测得分配比后，就容易求出分离因数。

例如，利用钠式强酸性阳离子交换树脂和配合剂柠檬酸分离稀土元素Ln 时，发生离子交换反应
+++↔+Na Ln R RNa Ln 3333
3
_33
_]][[]][[+++=Na Ln Na Ln K (13-3)
溶液种柠檬酸与稀土元素离子发生如下配合反应
3223)(3Cit H Ln Cit H Ln ↔+-+
配合物的积累稳定常数
3
2332]][[])([-+=Cit H Ln Cit H Ln β (13-4) 这时，稀土元素在离子交换树脂与溶液之间的分配比
3232_}]
][[][{])([][+--==Na Cit H Na K Cit H Ln Ln D Ln β (13-5) 此式种忽略了溶液中Ln 3＋ 离子以及除Ln(H 2Cit)3,此外的其他配合物的浓度且假定只有Ln 3
＋离子可以交换到树脂上。

溶液中柠檬酸H 3Cit 只离解成H 2Cit －和H ＋离子的解离常数为
]
[]][[32Cit H Cit H H Ka -+= (13-6) 由式（13.11）及（13.12）可得：
33}]
][[]][[{3+-
+=Na Cit H Na Na Kd K D Ln β .(13-7) 由上式不难得到某体系中两种稀土元素Ln1和Ln2z 之间的分离因数
1
122212/1ββK K D D a Ln Ln == (13-8) 由式(13-8)看得很清楚上述一对稀土元素的分离，不仅依赖于他们对离子交换剂亲和性的差
别，而且还依赖于他们的配合能力的差别。

实际上，人们常利用放射性示踪原子方法方便地测定元素在两相之间的分配比。

在分离工作中，由测得的两种元素的分配比可得到分离因数。

当然，由K 和β计算所得的分离因数经常与实验测定值不相符，在被分离元素含量很高时尤其明显。

可以想到，实验值偏离于计算值的主要原因是，实验测D 的条件与计算所用的K 和β的测定条件不一致以及得到（13.7）式做了简化假定。

例如，溶液的离子强度和温度不同，忽略活度系数以及溶液中In 3+生成其他配合物和以其他状态交换到树脂上等。

所以，为了使测定D 值的条件与实际分离体系相符，特别重要的是要对一对元素同时存在的条件进行测定，这时示踪原子方法就显示其特殊的优越性，因为依靠两种示踪原子的射线性质不同，可同时测得他们的分配比而不必分离。

第四节 配合物稳定常数的测定
配合物的稳定常数在化学上是最重要的。

用放射性示踪原子方法可测定配合物的稳定常数，由于射线的测量的灵敏度高，研究工作可以在中心金属原子浓度很低的条件下进行。

设金属离子Mn z+和配体L a-发生如下配合反应
)
222
na z n n z a z n z a
z n z ML nL M ML L M ML L M --+--+--+↔+↔+↔+ 各反应的逐级浓度稳定常数分别为
11)-..(13]
][[][10)-..(13]][[][9)-..(13]
][[][2
221⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯=⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯=⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯=-+--+--+-n a z na z n a z a z a z a z L M ML L M ML L M ML βββ 式中各组分的含量都用浓度不是用活度表示，因此配合物的逐级稳定常数β1β2……βn 都随浓度变化。

实验上通常是先测定一系列不同离子强度条件下的稳定常数，然后按实测数据外推到离子强度等于0处，从而得到与浓度无关的稳定常数。

为了测定配合物的逐级浓度稳定常数，通常引入函数Φ，Φ为溶液中金属离子的总浓度与配合的金属离子浓度之比
212[][]...[]........................................(1312)[]1[][]...[] (1313)
z z a z na n z a a a n n M ML ML M or L L L φφβββ+--+---+++=-=++++-
式中[L a-]表示溶液中自由配体的浓度。

Φ表征了金属离子的配合程度，可称为配合度。

令函数
2111231
[][]...[][]a a a n n a L L L L φψββββ------==++++
当[L a-]＝0时，1β＝1ψ。

换句话说，以1ψ对[L a-]作图，然后外推到[L a-]＝0处所得的。