免疫实验2

显色
补充
免疫标记技术
免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基 础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。 标记技术：将可被探测的示踪物质用化 学方法与化合物连接。 标记免疫分析：用可微量或超微量检 测的示踪剂标记抗原、抗体，检测免疫反应 结果并确定待检物。
三大经典标记技术 三大经典标记技术
免 疫 荧 光 技 术
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比 ELISA中应用最为广 泛的标记用酶
酶 免 疫 技 术
酶免疫组化
组织切片或其它标本中抗原的定位
均 相
酶免疫测定
液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
固相酶免疫测定
非均相
液相酶免疫测定
酶免疫技术的分类
酶和酶作用底物
Sandwich ELISA
indirect ELISA
ELISA检测抗原
Ag + Ab*
↔
Ag-Ab*
ELISA检测抗体
Ab + Ag*
↔
Ab-Ag*
ELISA检测抗体 Ag + Ab1 ↔ Ag-Ab1 Ag-Ab1 + Ab2* ↔ Ag-Ab1-Ab2*
间接ELISA
（可测多种细菌或病毒的抗体，用途广泛）
1 0.1 0.1 1:2
2 0.1wk.baidu.com0.1 1:4
3 0.1 0.1 1:8
4 0.1 0.1 1:16
特点：
灵敏度高、特异性强、 准确性好 酶标记试剂能够较长时 间保持稳定 操作简便、对环境没有 污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的 新方法。
对抗原或抗体进行定位、 定性或定量的测定分析
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要

分类：
酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
一、原理
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种固相酶免疫 测定的方法，目前广泛应用于各种抗原和抗体的检 测。其基本原理是：将抗原或抗体固定在固相载体 表面，并保持其免疫活性，再与酶标记抗体或抗原 联结，并保持并保留酶的活性，然后加入酶反应的 底物，后者被酶催化变为有色产物，反应颜色的深 浅可与相应抗原或抗体的量相关。 在本实验中，以辣根过氧化物酶标记抗人IgG抗 体，与相应抗原IgG结合，标记的酶可催化底物（邻 苯二胺）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反 应的存在。
二、材料： 1、人IgG包被的微量酶标反应板，
（1：1万，1：2万，1：4万，1：8万，1：16万）
2、酶标抗人IgG抗体稀释液、洗涤液（PH7.4， 0.01MPBS-Tween20）、底物溶液， 3、微量移液器、移液头、吸水纸、洗瓶、湿盒、 37℃恒温箱等。
三、方法：
1. 人IgG包被微量酶标反应板：取人IgG各100ul，分别加入 第1至5孔，设第6孔为对照。置37℃恒温箱2小时，取出， 移入4℃冰箱过夜。取出，用洗涤液洗3次，5分钟/次。 (略） 2. 用含小牛血清（BSA）的PH7.4PBS封闭，置37℃恒温箱， 30分钟，取出。用洗涤液洗3次，3~5分钟/次。（略） 3. 用微量移液器吸取100ul酶标抗人IgG抗体，分别加入第6 至1孔。置湿盒中，于37℃恒温箱中孵育30分钟。 4. 取出酶标板，用洗涤液洗3次，3~5分钟/次。 5. 按第6孔至第1孔的顺序，每孔各加100ul的底物溶液，置 37℃恒温箱中10-15分钟。 6. 观察显色反应。
ELISA的分类
√直接法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原 或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体 √间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 检测液相中未知抗体 √双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原
常用酶
碱性磷酸酶（AP）
菌源性AP 肠粘膜AP
β–半乳糖苷酶（β-Gal）
用于均相酶 免疫测定
酶和酶作用底物
常用底物
HRP的底物
HRP
DH2+H2O2→ → → D+2H2O
H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高 供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种
酶和酶作用底物
常用底物
四甲基联苯胺 TMB
固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
ELISA检测抗原的方法
双抗体夹心法
方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶
标抗体，加底物显色
应用：
二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等
+
双抗体夹心法测抗原
E
E
E E
E E
E
E
E
-
ELISA检测抗体的方法
寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）
荧光抗体技术的应用
免疫病理检测
肿瘤（人肝癌细胞）
酶免疫测定法原理及特点
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性

主要试剂:
酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
原理及特点
原理：
酶标抗体（抗原）与抗原 （抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应
荧光抗体技术
均相荧光免疫测定 荧光免疫技术 荧光免疫测定
（homogeneous fluorescence immunoassay）
非均相荧光免疫测定
（heterogeneous fluorescence immunoassay）
荧光抗体技术的基本原理
荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反 应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光
一、原理 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 是一种固相酶免 疫测定的方法，广泛应用于各种抗原或抗体的微量检测，其基本原 理是将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原－抗体反应在 固相表面进行，通过洗涤将固相上的抗原－抗体复合物与液相中的 游离成分分离，再利用各种操作方法，测定可溶性抗原或抗体。 BAS-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲 和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵 白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位 组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物 素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和 素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级 放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检 测未知抗原(或抗体)分子的目的。
操作注意事项： 1、正确掌握微量移液器的使用方法：一档取样， 二档加样。 2、正确洗涤酶标板：勿使洗涤液溢出，造成交 叉污染洗涤后应尽量甩干孔内残液。 3、注意加样顺序，加样品时应注意从最高稀释 度逐一加至最低稀释度。 4、底物OPD有一定致癌作用，故操作时应小心， 勿使底物沾染实验台等器材。 5，枪头（移液头）忌丢入实验台微生物专用的 废液缸内。
邻苯二胺 OPD
HRP的常见底物
5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS
酶和酶作用底物
HRP的常见底物
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
免疫酶测定法 (Enzyme ImmunoAssay,EIA)

用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。
辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)

特点：
高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值

三、操作步骤

1. 包被抗体：用0.05M PH9.6碳酸盐缓冲液将已 知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中 加0.1ml，4℃过夜(18-24小时)。次日，弃去孔内溶液， 用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。 2. 配制不同浓度的标准品：

孔号 NS (ml) 人IL-2 (ml) 稀释度
本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-2单抗包被于酶标 板上，标准品中的IL-2会与单抗结合，游离的成分被洗去。 加入生物素化的抗人IL-2抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和 素。生物素和亲和素特异性结合；抗人IL-2抗体与结合在单 抗上的人IL-2结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。 加入显色剂，若反应孔中有IL-2，辣根过氧化物酶会使无色 的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-2 浓度与OD450值之间呈正比，绘制标准曲线。
不同浓度IgG100ul/孔
1
2
3
4
5
6
酶标板
酶标抗人IgG抗体 用PBS洗涤3次（将洗板液加入每孔，3min后倾去），以 洗去未结合的游离酶标抗体。 底物 观察显色
四、结果
1 2 3 4 5 6
1~5孔，随着包被抗原浓度降低，颜色逐渐变淡 6孔（对照）无色
五、结论
ELISA可简便、快速、定量地检测抗原或抗体
放 射 免 疫 技 术
酶 免 疫 技 术
放射免疫技术－原理
放射免疫
RIA
其它 IRMA 以标记抗原与反 以过量标记抗体 放射受体分析 RRA 应系统中未标记 与抗原非竞争结 抗原竞争结合特 合，采用固相免 异性抗体来测定 疫吸附载体分离 放射配体结合 分析RBA 待检样品中抗原 游离和结合标记 量。 抗体。
的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原
进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性 和滴度测定。
Immunofluorescence, IF
荧光显微镜
利用一定波长的激发 光对样品进行激发，产生 一定波长的荧光，对样品 结构或其组分进行定性、 定位、定量观察检测。
荧光抗体技术的应用
病原体检测
细菌（藤黄微球菌 )
酶和酶作用底物
常用底物
AP的 底物 对-硝基苯磷酸酯 （ pNPP ） 经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β-D 半-乳糖苷 （ 4MUG ）
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计 测 量。
酶标记抗体或抗原
酶免疫技术的核心组成部分
免疫放射
二、放射免疫技术－常用的放射性 核素
常用标记核素
125I 3H
射线
γ
β
理化性
核素丰度 半衰期 标记方法 标记设备 测量条件
活泼
>90% 60.2d 简单 低廉 简单
差
－ 12.3y 复杂 昂贵 复杂
荧光免疫技术的类型
荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏 感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。
酶结合物 （conjugate） 酶标记物
通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的 结合物
酶联免疫吸附试验
一、基本原理
原理
1
包被
2
反应
加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体
洗涤
3
使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离
4
底物显色
定性或定量的分析
二、方法类型及反应原理
三个必要试剂




二、材料（人IL-2ELISA试剂盒） 1. 1ng/ml人IL-2标准品 2. 标准品稀释液 3. 生物素化抗人IL-2抗体（1: 100） 4. 酶结合亲和素（1: 100） 5. 洗涤液 6. 显色剂（过氧化氢－四甲基联苯胺） 7. 终止液 8. 抗人IL-2单抗包被板条 9. 封板胶纸
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
优点
一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体
应用
常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定
E
E
E
E
E
+
E E E E
间接法测抗体
-
人IL-2定量酶联检测
BAS-ELISA (生物素-亲和素ELISA)
酶联免疫吸附试验 Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA)

免疫标记技术（immunolabelling technique）: 是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或 电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行 的抗原抗体反应。 特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、 免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。