pH值对水剂法提取花生蛋白凝胶特性的影响

pH值对水剂法提取花生蛋白凝胶特性的影响
李侠; 章绍兵
【期刊名称】《《河南工业大学学报（自然科学版）》》
【年(卷),期】2019(040)005
【总页数】6页(P53-58)
【关键词】花生蛋白; pH值; 热致凝胶特性
【作者】李侠; 章绍兵
【作者单位】河南工业大学粮油食品学院河南郑州450001
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.2
0 引言
花生蛋白营养价值较高，含有多种氨基酸，易被人体消化吸收，具有持水性、凝胶性、成膜性等多种功能特性，被广泛用于食品加工领域[1]。

凝胶性是花生蛋白主要的功能性质之一，添加到食品中可极大地改善产品的外观形态。

蛋白质的凝胶化是一个复杂的过程，首先是蛋白质分子受到外界条件的作用发生不同程度的变性充分伸展，然后蛋白质和蛋白质、蛋白质和溶剂之间相互作用，最后蛋白质之间发生相互聚集，形成致密的三维网状结构[2]。

Wang[3]研究表明，在pH值为7的条件下酶改性花生蛋白，获得的蛋白质凝胶强度最佳。

何轩辉[4]研究发现超高压能显著改善花生分离蛋白热致凝胶的性能。

吴海文[5]研究花生浓缩蛋白凝胶形成机
理时发现，pH值为 3时盐离子的加入有利于形成强凝胶，但pH值为7时盐离子的加入不利于形成凝胶。

除了蛋白质分子本身，pH值对凝胶强度的影响不容忽视，目前虽有较多相关研究[6-7],但只是侧重比较不同pH值条件下蛋白凝胶强度的差异，并未从蛋白质结构性质等方面解释原因。

作者以花生仁为原料，采用水剂法提取花生蛋白，研究pH值对花生蛋白热致凝胶性质的影响，同时分析不同pH值条件下花生蛋白的部分结构性质，为花生蛋白凝胶机制研究提供理论参考。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
花生仁(蛋白质含量24.25%，脂肪含量49.16%)：市售。

氢氧化钠、硫酸钾、磷酸二氢钠：洛阳昊华化学试剂有限公司；硫酸铜、氯化钠、十二烷基硫酸钠：天津市天力化学试剂有限公司；甘氨酸、硼酸、乙二胺四乙酸：天津市科密欧化学试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷：上海山浦化工有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备
FE20型pH计、ML204型电子天平：梅特勒托利多仪器有限公司；MARS60哈
克流变仪：赛默飞世尔有限公司；G9800A荧光分光光度计：美国安捷伦有限公司；CLE10C高速万能粉碎机：浙江温岭创立器械厂；TAXT质构仪：英国Stable Micro Systrm公司；DT4B低速离心机：北京时代离心机有限公司；LG18C冷冻离心机：北京科学仪器厂有限公司；DZKW电热恒温水浴锅：北京永光明医疗仪
器有限公司。

1.3 花生蛋白的提取
将花生仁放入万能粉碎机打成浆，取一定量的花生浆，加去离子水充分溶解，调节pH值至10，室温下放置2～3 min，然后在50 ℃水浴锅中150 r/min振荡30 min，4 500 r/min离心15 min，去除油和乳状层，取水相，调节pH值至4.5进
行酸沉，清洗沉淀2次，冻干即得到花生蛋白(蛋白质含量81.56%)。

1.4 花生蛋白热致凝胶的制备
将花生蛋白配成质量分数为15%的溶液，用0.1 mol/L的氢氧化钠、盐酸调节蛋
白溶液的pH值，置于90 ℃恒温水浴锅中加热60 min,取出后立即放入冰水浴中
冷却至室温，将样品放在4 ℃冰箱中储藏24 h后进行凝胶性质的测定，测前样品需在室温下放置30 min。

1.5 花生蛋白凝胶硬度的测定
采用 TA-XT2 质构仪测定，专用探头(P/0.5 探头)。

运行模式：测试速度0.8
mm/s，测前速度2.0 mm/s，测后速度0.8 mm/s，下压距离50%，触发力0.8 g，数据采集速率180/s，凝胶硬度(N)等于第一次压缩过程中的峰值力(Force 2)。

1.6 花生蛋白凝胶持水性的测定
称取5 g凝胶置于10 mL离心管中，离心管的质量为W，离心前样品和离心管的质量为W2，8 000 r/min离心20 min，称除去水后样品和离心管的质量为W1。

WHC(持水率)
1.7 花生蛋白表面疏水性的测定
参考Hu等[8]的方法，采用荧光探针法测定花生蛋白表面疏水性。

用 0.01 mol/L pH 8的磷酸盐缓冲溶液配成不同梯度的蛋白溶液，取 4 mL 蛋白溶液(加热条件下的表面疏水性测定：取4 mL 蛋白溶液在90 ℃恒温水浴锅中加热20 min，取出
冷却到室温)加入20 μL ANS(8 mmol/L)溶液，振荡混匀，测定混合液的荧光强度。

测试条件：激发波长380 nm，发射波长480 nm，狭缝 5 nm，扫描速率 10
nm/s，以荧光强度对蛋白溶液浓度作图，用曲线斜率表示样品表面疏水性。

1.8 花生蛋白内源荧光光谱的测定
参考梁晗妮[9]的方法测定内源荧光光谱，有所改动。

用 0.01 mol/L pH 8的磷酸
盐缓冲溶液将蛋白样品配成 1 mg/mL的溶液，取适量的蛋白样品，用荧光分光光
度计进行测定。

扫描条件：激发波长 290 nm，扫描范围 300～400 nm。

1.9 花生蛋白游离巯基的测定
参照 Beveridge等[10}的方法进行测定。

称取花生分离蛋白60 mg于10 mL
Tris-Gly (pH 8.0)缓冲液中充分溶解，然后9 000 r/min离心20 min。

游离巯基测定：2 mL上清液中(加热条件下的游离巯基含量测定：取2 mL上清液在90 ℃恒温水浴锅中加热20 min，取出冷却到室温)加入80 μL Ellman’s试剂、4 mg/mL DTNB(5，5′-二硫代-双-2-硝基苯甲酸)，混匀，5 min 后测 412 nm处吸光度。

SH(μmol/g)=73.53A412/C,
式中：A412为412 nm处的吸光度；C为样品质量浓度，mg/mL；73.53由
106/(1.36×104)计算得出，1.36×104表示摩尔消光系数。

1.10 花生蛋白热致凝胶动态流变性质的测定
动态流变试验于哈克流变仪中进行，金属圆片直径为35 mm，蛋白溶液置于金属圆片上面，间隙1 mm，用棉签擦去周围的样品，为防止水分蒸发，在其周围涂
抹一层硅油。

温度扫描过程：将样品以2 ℃/min的速度从25 ℃升到95 ℃，在
95 ℃下保持10 min，再以4 ℃/min的速度降到25 ℃，记录整个升温降温过程
中的储存模量G′与耗能模量G″。

1.11 凝胶中蛋白质分子间作用力的测定
根据Matsumoto[11]的方法进行测定。

样品采用5种溶剂进行处理。

A：0.06 mol/L NaCl；B：0.8 mol/L NaCl；C: 0.8 mol/L NaCl+1.6 mol/L尿素；D：
0.8 mol/L NaCl+7 mol/L尿素；E：0.8 mol/L NaCl+7 mol/L尿素+0.6 mol/L β-巯基乙醇。

取2 g凝胶样品放入溶剂中，充分搅拌2 h，然后4 ℃下10 000
r/min离心30 min，上清液蛋白质含量采用Lowry法测定。

蛋白质溶解度(%)：
上清液中蛋白质含量与总蛋白质含量之比；离子键：凝胶在溶剂A和溶剂B中的
溶解度之差；氢键：在溶剂C和溶剂B中的溶解度之差；疏水相互作用：在溶剂
D和溶剂C中的溶解度之差；二硫键：在溶剂E和溶剂D中的溶解度之差。

1.12 数据分析
每个样品平行重复试验3次，采用Origin 8.5和SPSS 20.0软件进行数据分析。

2 结果与讨论
2.1 pH值对花生蛋白凝胶硬度和持水性的影响
凝胶性是蛋白质的重要功能性质之一，用来表征蛋白质在变性后形成的三维网络结构。

不同pH值对花生分离蛋白热致凝胶的影响如图1所示。

由图1可知，pH 3
的样品凝胶硬度在所有样品中最大，碱性条件下pH 8的样品凝胶硬度较高，而中性(pH 6.5)条件下凝胶硬度最弱。

由此可见，花生蛋白在等电点(pH 4.5)附近有利于形成强凝胶，可能原因是在等电点附近蛋白质分子间引力大于斥力，聚集过程很活跃，形成的凝胶网络致密，所以凝胶结构强度大。

但在等电点时花生蛋白易形成沉淀，凝胶能力弱，这与前人的研究结果一致[6]。

当pH值偏离花生蛋白等电点
过多时，凝胶强度较弱，这是因为分子间的主要作用力表现为斥力，空间构象相对松散，所形成的凝胶网络结构强度较低。

如图2所示，pH值同样影响凝胶持水性，pH 3时花生蛋白的凝胶持水性最强，pH 7时凝胶的持水性最弱。

Kao等[12]报道，添加硫酸钙的豆腐凝胶具有致密的三维网络结构，同时具有较高的凝胶硬度和持水性。

注：相同字母相同表示无显著性差异，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

下同。

图1 pH值对花生蛋白凝胶硬度的影响Fig.1 Effect of pH on the hardness of peanut protein gel
图2 pH值对花生蛋白凝胶持水性的影响Fig.2 Effect pH on the water holding capacity of peanut protein gel
2.2 pH值对花生蛋白凝胶动态流变性质的影响
流变仪可以用来测定蛋白质凝胶中储能模量(G′)的变化，G′表示凝胶样品的弹性特性或材料的固体样性质，与凝胶的弹性有关[13]。

如图3所示，在加热阶段，G′随温度的升高而升高，当温度到达60 ℃左右，花生蛋白开始变性及部分聚集凝胶开始形成，蛋白溶液中部分黏性物质转化为弹性物质[14]，之后凝胶进入强化阶段，三维网络结构形成，凝胶体系增强，形成不可逆且紧密的凝胶体。

降温阶段是G′
显著增加的时间段，说明凝胶结构的强化主要在降温阶段完成。

Sun 等[15]指出，在降温阶段，花生蛋白凝胶网络结构主要靠疏水相互作用和氢键来维持，凝胶三维网络结构的形成主要发生在此阶段。

此外，冷却阶段发生氧化反应，游离巯基基团转化为二硫键。

疏水相互作用、氢键和二硫键共同作用形成致密的三维网络结构。

图3 pH值对花生蛋白凝胶动态流变性质的影响Fig.3 Effect of pH on the dynamicrheological property of peanut protein gel
由图3可知，在凝胶形成过程中，pH 3的凝胶样品G′始终显著高于pH 7和pH
8的凝胶样品G′，这与凝胶强度和持水性结果一致。

如前所述，这可能与蛋白质
分子间在pH 3时所带同种电荷较少、相互引力更强有关。

然而，在碱性范围内，pH 8的凝胶样品强度显著高于pH 7样品的强度，这显然不能用引力大小的变化
来解释，因为pH 7时蛋白质分子所带电荷较pH 8时少，此时分子间相互引力更大。

因此，在不同pH条件下花生蛋白凝胶强度存在显著差异，可能还与其分子结构性质的改变密切相关。

2.3 凝胶中蛋白分子间作用力分析
凝胶强度取决于蛋白变性程度和聚集速率[16]，三维网络的形成是蛋白-蛋白、蛋
白-溶剂间作用力相互平衡的结果[17]，通过测定凝胶在不同溶液中的溶解度变化，可以间接分析形成凝胶的主要作用力。

氯化钠主要破坏离子键,不同浓度的尿素破
坏氢键和疏水相互作用，β-巯基乙醇破坏二硫键。

由图4可看出，花生蛋白凝胶
在高浓度尿素中溶解度最大，其次为含β-巯基乙醇溶液，而盐溶液中溶解度最小。

结果表明疏水相互作用在花生凝胶形成过程中发挥着主要作用，二硫键其次，离子键和氢键在凝胶形成过程中作用较小。

图4 凝胶中蛋白质分子间作用力分析Fig.4 Analysis of the protein intermolecular force in gel
2.4 pH值对花生蛋白表面疏水性的影响
表面疏水性对维持蛋白质结构的稳定性起重要作用，并与其凝胶性质密切相关[18]。

蛋白质表面疏水性大小表示溶液的极性环境与蛋白质内部疏水基团结合的状况。

如图5所示，花生蛋白疏水性在常温和加热的条件下都是在pH 3的情况下最大，这可能是因为在极端pH值条件下蛋白质发生酸解，内部疏水基团暴露，疏水性增大[19]。

比较中性和碱性条件下花生蛋白的表面疏水性发现，在不加热时各蛋白样品的表面疏水性接近，然而加热后，pH 8样品的表面疏水性显著高于其他样品，增幅最大。

由于疏水作用力是形成蛋白质凝胶的重要作用力之一[20]，这或许能够成为解释在此pH值时花生蛋白凝胶强度和持水性较好的原因。

图5 pH值对花生蛋白表面疏水性的影响Fig.5 Effect of pH on the surface hydrophobicity of peanut protein
2.5 pH值对花生蛋白内源荧光光谱的影响
由图6可以看出，在中性条件下，花生蛋白内源荧光最大发射波长为 340 nm，在碱性(pH 8和pH 9)条件下花生蛋白的荧光最大发射波长基本没有发生偏离。

但在pH 3时，花生蛋白的峰位出现了明显的红移，这也说明在此条件下蛋白质空间构象遭到破坏，导致分子内部疏水区的色氨酸残基暴露在水溶液中，花生蛋白在酸性条件下有更加松散的空间结构，这与常温下表面疏水性的测定结果相一致。

图6 pH值对花生蛋白荧光强度的影响Fig.6 Effect of pH on the fluorescence intensity spectra of peanut protein
2.6 pH值对花生蛋白游离巯基含量的影响
Shimada等[21]研究发现，在凝胶化过程中，游离巯基通过氧化反应形成二硫键，从而影响凝胶网络结构和凝胶强度。

根据含游离巯基的蛋白质易与Ellman’s试
剂发生反应的原理，对游离巯基的含量进行测定[22]，由图7可以看出，在不加热条件下，pH 3时花生分离蛋白游离巯基含量最高，表明此时分子可能因为发生了酸解变性，导致内部游离巯基的暴露。

而在中性、碱性条件下，花生蛋白的表面游离巯基含量均处于较低水平。

这与Hwang[23]研究的酸性条件下巯基含量增加的
结果一致。

而在蛋白质溶液受热后，由于热变性作用花生蛋白的表面游离巯基含量均显著增加，pH 3时含量仍是最高。

在中性和碱性条件下，花生蛋白的表面游离巯基含量随着pH值升高而增加，其中原因有待于进一步研究。

pH 8样品的凝胶
硬度高于pH 7样品，这也可能与前者在受热变性后具有更高的游离巯基含量相关。

图7 pH值对花生蛋白游离巯基含量的影响Fig.7 Effect of pH on the content of free sulfydryl in peanut protein
3 结论
pH值对花生蛋白的凝胶和结构性质具有显著影响。

pH 3时花生蛋白凝胶具有最
大的凝胶硬度、持水性和储能模量(G′)；在中性和碱性范围内，pH 8时花生蛋白
凝胶的强度、持水性和G′最高。

疏水相互作用在花生蛋白凝胶形成过程中发挥最
主要作用，二硫键其次。

pH 3时花生蛋白的表面疏水性和游离巯基含量最高，内源荧光光谱发生了明显的红移；而在中性和碱性范围内，pH 8时花生蛋白表面疏水性最强，游离巯基含量较高。

参考文献:
【相关文献】
[1] 赵晓燕, 孙秀平, 陈锋亮, 等. 花生蛋白的研究进展与开发利用现状[J]. 中国粮油学报, 2011,
26(12):118-122.
[2] CHEM A. Functionality and protein structure[M]. Washington:ACS Press,1979:81-103.
[3] WANG Q. Peanut processing characteristics and quality evaluation[M]. Singapore: Springer Nature Singapore Pte Ltd,2018.
[4] 何轩辉.超高压对花生分离蛋白凝胶特性的影响及其机理研究[D].北京:中国农业科学院,2013.
[5] 吴海文.花生浓缩蛋白的制备、凝胶形成机理及其应用研究[D]. 北京:中国农业科学院,2009.
[6] 冯治平, 钟世荣, 吴士业. pH值对花生分离蛋白凝胶形成特性影响研究[J]. 四川理工学院学报(自然科学版), 2009, 22(6):60-62.
[7] 连喜军, 鲁晓翔, 陈彧, 等. pH值和金属离子对大豆分离蛋白凝胶形成的作用[J]. 江苏农业科学，2007(1)：162-164.
[8] HU X, ZHAO M, SUN W, et al. Effects of microfluidization treatment and transglutaminase cross-linking on physicochemical, functional, and conformational properties of peanut protein isolate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(16):8886-8894.
[9] 梁晗妮. 豆类蛋白质的乳化性质及其结构-功能相关性研究[D]. 广州：华南理工大学, 2014.
[10] BEVERIDGE T, TOMA S J, NAKAI S. Determination of SH-and SS-groups in some food p roteins using ellman′s reagent[J]. Journal of Food Science,1974, 39(1):49-51.
[11] MATSUMOTO J J. Chemical deterioration of muscle proteins during frozen
storage[M]. Washington:American Chemical Society,1980.
[12] KAO F J, SU N W, LEE M H. Effect of calcium sulfate concentration in soymilk on the microstructure of firm tofu and the protein constitutions in tofu whey[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(21):6211-6216.
[13] SOK LINE V L, REMONDETTO G E, SUBIRADE M. Cold gelation of β-lactoglobulin oil-
in-water emulsions[J]. Food Hydrocolloids, 2005, 19(2):269-278.
[14] CANDO D, MORENO H M, TOVAR C A, et al. Effect of high pressure and/or temperature over gelation of isolated hake myofibrils[J]. Food and Bioprocess Technology, 2014, 7(11):3197-3207.
[15] SUN X D, ARNTFIELD S D. Gelation properties of salt-extracted pea protein isolate catalyzed by microbial transglutaminase cross-linking[J]. Food Hydrocolloids, 2011,
25(1):25-31.
[16] AN H, PETERS M Y, SEYMOUR T A. Roles of endogenous enzymes in surimigelation[J]. Trends in Food Science & Technology, 1996, 7(10):321-327.
[17] VENUGOPAL V, DOKE S N, NAIR P M. Gelation of shark myofibrillar proteins by weak organic acids[J]. Food Chemistry, 1994, 50(2):185-190.
[18] HU H, LI-CHAN E C Y, WAN L, et al. The effect of high intensity ultrasonic pre-treatment on the properties of soybean protein isolate gel induced by calcium sulfate[J].
Food Hydrocolloids, 2013, 32(2):303-311.
[19] 赵谋明, 辛佩贤, 陈楠楠, 等. 花生球蛋白和伴花生球蛋白在酸性条件下亚基结构的变化规律[J]. 现代食品科技,2016(3):30-35.
[20] 胡坤, 方少瑛, 王秀霞, 等. 蛋白质凝胶机理的研究进展[J]. 食品工业科技, 2006, 27(6):202-205.
[21] SHIMADA K, CHEFTEL J C. Determination of sulfhydryl groups and disulfide bonds in heat-induced gels of soy protein isolate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1988, 36(1):147-153.
[22] CAMPBELL L J, GU X, DEWAR S J, et al. Effects of heat treatment and glucono-δ-lactone-induced acidification on characteristics of soy protein isolate[J]. Food Hydrocolloids, 2009, 23(2):344-351.
[23] HWANG D C, DAMODARAN S. Metal-chelating properties and biodegradability of an ethylene diaminetetraacetic acid dianhydride modified soy protein hydrogel[J]. Journal of Applied Polymer Science, 1997, 64(5):891-901.。