柠檬酸
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粗柠檬酸
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发酵液预处理 预处理是指待发酵液加热至75—90℃, 可以及时杀死柠檬酸产生菌及其他杂菌, 终止发酵作用。 同时使发酵液中部分蛋白质变性、絮凝、 降低酵液浓度利于过滤。 此外也可能使菌体内部分柠檬酸释放出 来。
丙酮酸氧化脱酸生成乙酰-CoA和CO2固 定两个反应的平衡,以及柠檬酸合成酶 不被调节,增强了合成柠檬酸能力。
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3、顺乌头酸水合酶
顺乌头酸水合酶失活是阻断TCA循环,大量生成柠檬 酸的必要条件。 柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱, 该酶是个含铁的非血红蛋白。在菌体生长到 研究表明,黑曲霉中顺乌头酸水合酶,它在催化 足够菌数时,适量加入亚铁氰化钾(黄血 时能建立下面的平衡:柠檬酸 :顺乌头酸:异柠檬酸 Fe++ 生成络合物, =盐),使与铁硫中心的 90:3:7。
我国柠檬酸行业从产量上位居世界第一 并获得成功,从而确定了中国柠檬酸生产的
这一主要工艺路线。薯干粉深层发酵柠檬酸,
原料丰富,工艺简单,不需添加营养盐,产
率高,边糖化边发酵的工艺,生产周期比国
外要短,是中国独特的先进工艺。
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丰原生化 玉米为原料
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或碱性时,会产生较多草酸和葡萄糖酸。
生长最适温度为33~37℃,产酸最适温度 在28~30℃。
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二、 柠檬酸发酵微生物
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三、柠檬酸生物合成途径
柠檬酸生物合成途径有多种,原料不同, 菌种不同,途径也不同,黑曲霉可以由糖类、 乙醇为原料发酵生产柠檬酸,这是一个非常 复杂的生理生化过程。对柠檬酸的发酵机理 长期以来基于假设。 葡萄糖 乙酸
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a 、 通气与搅拌(溶氧)对柠檬酸发酵的影响
黑曲霉
发酵15—30h这一阶段,菌体大 生长繁殖阶段: 量生长繁殖耗氧量最大。 耗氧虽略有减弱,而在这一时期缺 产酸阶段: 氧造成的损伤是不可逆的。
黑曲霉
因此在整个发酵过程中一刻也不能停 止通气和搅拌,才能保证溶氧的供应。
CO2+丙酮酸+ATP+H2O
Mg++
草酰乙酸+ADP+Pi
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柠檬酸合成酶
顺乌头酸合成酶
异柠檬酸脱氢酶
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葡萄糖 黑 曲 霉 中 柠 檬 酸 的 代 谢
6-磷酸果糖 磷酸果糖激酶 1.6-二磷酸果糖 丙酮酸 丙酮酸羧化酶
CO 2 HMP
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③种子罐培养。种子罐体积一般为发酵 罐的1/10,薯干粉浓度为8%一14%, 添加0.15%(NH4)2SO4。 种子罐培养温度为32℃,培养时间22— 24h,至略微产酸即转入发酵罐中。
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柠檬酸发酵条件的影响
温度、pH、种子质量、溶氧、微量元素
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二、 柠檬酸发酵微生物
1) 黑曲霉(Aspergillus niger)
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二、 柠檬酸发酵微生物
2) 黑曲霉(Aspergillus niger)的生理特 征 黑曲霉生长最适pH值因菌种而异,一般为 pH3~7;产酸最适pH为1.8~2.5。pH值中性
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中和 Ca 2+ 在一定温度和pH条件下可与柠檬酸 作用生成柠檬酸钙。出于形成的 Ca3(C6H5O7)2· 4H2O在水中的溶解度极小, 因而能形成沉淀面与其他杂质,如糖、可 溶性蛋白等分离。 生石灰(CaO)、熟石灰[Ca(OH)2 ]、氯化 钙(CaCl2)以及碳酸钙等均可作为中和剂, 但最常用的是碳酸钙。 碳酸钙中和时的反应方程式为:
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柠檬酸生产工艺
液体表面发酵法
液体发酵法
液体深层发酵法
固体发酵法
薄层发酵法 厚层发酵法
曲醅厚度
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固态发酵
固态发酵是以薯干粉、含淀粉的农副 产品为原料,配好培养基后,在常压 下蒸煮,冷却至接种温度,接入种曲, 装入曲盘,在一定温度和湿度条件下 发酵。
正烷烃氧化成脂肪酸 脂肪酸β氧化生成乙酸 与乙酸代谢途径相同完成柠檬酸合成
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四、柠檬酸发酵工艺
(一)柠檬酸发酵用原料
柠檬酸发酵的原料有三大类
1.
糖质原料(甘蔗废糖蜜、甜菜废糖蜜)、
2.
淀粉质原料(主要是番薯、马铃薯、
木薯、玉米等)。 正烷烃类原料。
3.
则该酶失活或活性减少,而积累柠檬酸。添 加顺乌头酸酶抑制剂,如亚铁氰化钾(黄血 盐 )可促进柠檬酸积累。
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4.异柠檬酸脱氢酶
柠檬酸浓度升高到某一水平就抑制异柠 檬酸脱氢酶活力,从而进一步促进了柠 檬酸自身积累
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随着柠檬酸积累,pH降低到一定 程度时,使顺乌头酸酶和异柠檬酸 脱氢酶失活(顺乌头酸酶、异柠檬 酸酶在pH2.0时失活),更有利于柠 檬酸的积累及排出细胞外。
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b、pH的影响
黑曲霉边糖化边产酸 菌体生长期pH:4.5左右 糖化适宜pH:3~4 产酸阶段pH :2~2.5 在薯干粉的柠檬酸发酵中,初始pH(5.5), 48h后pH会到达2.0,抑制糖化酶的作用。控制低 风量,减慢菌体生长,有充分时间糖化完全。
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柠檬酸
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主要内容
一、柠檬酸生产的历史 二、 柠檬酸发酵微生物 三、柠檬酸生物合成途径 四、柠檬酸发酵工艺 五、柠檬酸提取
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柠檬酸
柠檬酸(Citric acid),又名枸橼酸,分子式为 C6H8O7。外观为白色颗粒状或白色结晶粉末,无 臭,具有令人愉快的强烈的酸味,相对密度为 1.6550。柠檬酸易溶于水、酒精、不溶于醚、酯、 氯仿等有机溶剂。柠檬酸是生物体主要代谢产物 之一。
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酸解 酸解是指柠檬酸钙与硫酸等强酸作用,在 强酸作用下使柠檬酸钙转变为柠核酸游离 出来,同时形成硫酸钙。由于后者的溶解 度极小,难溶于水而形成沉淀,从而达到 进一步的分离纯化作用。
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净化 净化工艺包括脱色和离子交换树脂除去 杂质离子
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提取柠檬酸的方法主要有钙盐法、离 子交换法、萃取法、电渗析法以及近 年来发展起来的色谱分离法;但目前 普遍使用的仍然是钙盐法。
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钙盐法
柠檬酸的上清液中加人CaCO3或Ca(OH)2中和, 使柠檬酸生成柠檬酸钙沉淀 固液分离后,柠檬酸钙再用硫酸酸解,生 成柠檬酸水溶液 再经过脱色、去除阴、阳杂离子后得到提 取液进入浓缩、结晶工序得到纯柠檬酸固 体产品.
通过阳离于交换柱可除去Ca2+、Fe2+等阳离 子,最常用的阳离子交换树脂是732树脂。 如果柠檬酸液中含有较多的阴离子,可用阴 离子交换树脂除去。
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结晶
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c 、微量元素与柠檬酸发酵
Mg2+ 、Zn2+、 Mn2+、 Cu2+、 Fe2+和S、P、K、 Na等元素影响黑曲霉生长。
Mn2+参与黑曲霉的多种代谢, Mn2+既是异柠檬
酸脱氢酶和草酰乙酸酶的组成都分,又是TCA循环中 多种酶的激活剂,还参与蛋白、核酸的合成, Mn2+浓度高时,柠檬酸合成明显受影响,其作用远 甚于Fe2+ 。如前所述, Mn2+的不足可使细胞内 NH4+浓度升高.从而解除柠檬酸对酵解途径的抑制作 用。
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积累柠檬酸要求在发酵过 程中培养基中Mn 2+浓度 要低, 导致NH 4+浓度升 高;侧系呼吸链,发酵时 不能缺氧。
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2、丙酮酸羧化酶:组成型酶,不被调节控制。 就源源不断地提供草酰乙酸。 3、柠檬酸合成酶:柠檬酸合成酶是TCA循环第 一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。
烷烃
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葡萄糖为碳源
糖经EMP、HMP途径形成丙酮酸。
黑曲霉生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径, 前者EMP:HMP=2:1,后者EMP:HMP=4:1
磷酸果糖激酶
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丙酮酸生成草酰乙酸和乙酰CoA
丙酮酸经CO2固定生成草酰乙酸(丙酮酸羧化酶)
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五、柠檬酸的提取工艺
发酵液中除含柠檬酸外,还含有黑曲霉菌丝 体及自溶物、原料残渣(主要是纤维素)、未利 用的还原糖、非发酵性糖以及发酵过程产生的 色素及其他有机酸等。
我国在提取率、机械化程度和劳动生产率 等方面比较落后,因而在国内研究从发酵 液中高效、低能耗地提取柠檬酸是一个极 有意义的课题.
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NADH被氧化了,又没有产生ATP。
为了解释这种现象,有人提出了一种假设: 菌体内存在一条侧系呼吸链 实验证明,某些微生物体内确实存在侧系 呼吸链,该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧, 如在柠檬酸的发酵中,发酵液的溶氧浓度 在很低水平维持一段时间,或中断供氧一 段时间(20分钟),则这一侧系呼吸链不 可逆的失活,其结果是菌体不再产酸,而 是产生了大量的菌体。
乙酰CoA
草酰乙酸 柠檬酸合成酶
柠檬酸
顺乌头酸酶
顺乌头酸 α-酮戊二酸 异柠檬酸
异柠檬酸脱氢酶
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1、磷酸果糖激酶(PFK) NH4+激活PFK的活性,ATP抑制PFK活性。
研究表明,柠檬酸产生菌——黑曲霉如果生 长在Mn+缺乏的培养基中,NH4+浓度异常的高,可 达到25mmol/L,显然,由于Mn+的缺乏,使得微生 物体内NH4+浓度升高,使得葡萄糖源源不断的合 成大量的柠檬酸。
1938 年 Perquin 和 1942 年 Karrow 进行了柠檬酸的 深层 发酵研究。 1951年美国Miles公司首先以淀粉质为原料,经水解后 深层发酵大规模生产柠檬酸。
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我国1966年后,天津市工业微生物研究所、 上海市工业微生物研究所相继开展用黑曲霉 进行薯干粉原料深层发酵柠檬酸的试验研究,
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种子制备
①斜面种子培养:斜面培养基为10-12。Bx的麦 芽汁或米曲汁,也可采用20%马铃薯煮出汁琼 脂培养基,33—35℃培养4—5d,至斜面长满 孢子即可。
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②麸曲制备。用1000ml角烧瓶装麸皮40g左右。 麸曲的含水量要合适,一般控制在60%一65% 左右,麸曲种子的培养温度约34℃.培养1天 后要“敲瓶”一次,使之上下翻动。
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黑曲霉利用糖类为原料生产柠
檬酸时,柠檬酸如何积累?
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乙酸为碳源
乙酰CoA 草酰乙酸 乙酸
苹果酸乙酰CoA乙醛酸
柠檬酸
延胡索酸
乙酸
异柠檬酸
琥珀酸
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TCA循环 乙醛酸循环
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正烷烃为碳源
假丝酵母属
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液态浅盘发酵
液态浅盘发酵多以糖蜜为原料,其生 产方法是将灭菌的培养液通过管道转 入一个个发酵盘中,接入菌种,待菌 体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。发 酵时要求在发酵室内通入无菌空气。
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以薯干为原料液体深层发酵法
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一、柠檬酸生产的历史
柠檬酸1784年由Scheels从柠檬中提取发现。 1893年前,主要用柑橘、菠萝果实提取柠檬酸。 1893年德国微生物学家 Wehmer 发现二种青霉菌可以生 成柠檬酸。 1917年Currie使用黑曲霉浅盘发酵生产柠檬酸。
1923年美国科学家研究成功了以废糖蜜为原料的 浅盘 法柠檬酸发酵,并在比利时设厂生产。