柠檬酸

23:20:47
南京师范大学金女院
38
粗柠檬酸
23:20:47
南京师范大学金女院
39

发酵液预处理 预处理是指待发酵液加热至75—90℃， 可以及时杀死柠檬酸产生菌及其他杂菌， 终止发酵作用。 同时使发酵液中部分蛋白质变性、絮凝、 降低酵液浓度利于过滤。 此外也可能使菌体内部分柠檬酸释放出 来。
丙酮酸氧化脱酸生成乙酰-CoA和CO2固 定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶 不被调节，增强了合成柠檬酸能力。
23:20:47
南京师范大学金女院
17
3、顺乌头酸水合酶

顺乌头酸水合酶失活是阻断TCA循环，大量生成柠檬 酸的必要条件。 柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱， 该酶是个含铁的非血红蛋白。在菌体生长到 研究表明，黑曲霉中顺乌头酸水合酶，它在催化 足够菌数时，适量加入亚铁氰化钾（黄血 时能建立下面的平衡：柠檬酸 :顺乌头酸:异柠檬酸 Fe++ 生成络合物， ＝盐），使与铁硫中心的 90:3:7。
我国柠檬酸行业从产量上位居世界第一 并获得成功，从而确定了中国柠檬酸生产的
这一主要工艺路线。薯干粉深层发酵柠檬酸，
原料丰富，工艺简单，不需添加营养盐，产
率高，边糖化边发酵的工艺，生产周期比国
外要短，是中国独特的先进工艺。
23:20:46 南京师范大学金女院 4

丰原生化 玉米为原料
23:20:46
或碱性时，会产生较多草酸和葡萄糖酸。


生长最适温度为33~37℃，产酸最适温度 在28~30℃。

23:20:46
南京师范大学金女院
7
二、 柠檬酸发酵微生物
23:20:46
南京师范大学金女院
8
三、柠檬酸生物合成途径
柠檬酸生物合成途径有多种，原料不同， 菌种不同，途径也不同，黑曲霉可以由糖类、 乙醇为原料发酵生产柠檬酸，这是一个非常 复杂的生理生化过程。对柠檬酸的发酵机理 长期以来基于假设。 葡萄糖 乙酸
23:20:47
南京师范大学金女院
32
a 、 通气与搅拌(溶氧)对柠檬酸发酵的影响
黑曲霉
发酵15—30h这一阶段，菌体大 生长繁殖阶段： 量生长繁殖耗氧量最大。 耗氧虽略有减弱，而在这一时期缺 产酸阶段： 氧造成的损伤是不可逆的。
黑曲霉
因此在整个发酵过程中一刻也不能停 止通气和搅拌，才能保证溶氧的供应。
CO2+丙酮酸+ATP+H2O
Mg++
草酰乙酸+ADP+Pi
23:20:46
南京师范大学金女院
11
柠檬酸合成酶
顺乌头酸合成酶
异柠檬酸脱氢酶
23:20:47
南京师范大学金女院
12
葡萄糖 黑 曲 霉 中 柠 檬 酸 的 代 谢
6-磷酸果糖 磷酸果糖激酶 1.6－二磷酸果糖 丙酮酸 丙酮酸羧化酶
CO 2 HMP
23:20:47
南京师范大学金女院
30

③种子罐培养。种子罐体积一般为发酵 罐的1／10，薯干粉浓度为8％一14％， 添加0.15％(NH4)2SO4。 种子罐培养温度为32℃,培养时间22— 24h，至略微产酸即转入发酵罐中。
23:20:47
南京师范大学金女院
31
柠檬酸发酵条件的影响

温度、pH、种子质量、溶氧、微量元素
南京师范大学金女院
5
二、 柠檬酸发酵微生物

1) 黑曲霉（Aspergillus niger）
23:20:46
南京师范大学金女院
6
二、 柠檬酸发酵微生物

2) 黑曲霉（Aspergillus niger）的生理特 征 黑曲霉生长最适pH值因菌种而异，一般为 pH3~7；产酸最适pH为1.8~2.5。pH值中性
23:20:47
南京师范大学金女院
40




中和 Ca 2+ 在一定温度和pH条件下可与柠檬酸 作用生成柠檬酸钙。出于形成的 Ca3(C6H5O7)2· 4H2O在水中的溶解度极小， 因而能形成沉淀面与其他杂质，如糖、可 溶性蛋白等分离。 生石灰(CaO)、熟石灰[Ca(OH)2 ]、氯化 钙(CaCl2)以及碳酸钙等均可作为中和剂， 但最常用的是碳酸钙。 碳酸钙中和时的反应方程式为：
23:20:47
南京师范大学金女院
24
柠檬酸生产工艺
液体表面发酵法

液体发酵法
液体深层发酵法

固体发酵法
薄层发酵法 厚层发酵法
曲醅厚度
23:20:47
南京师范大学金女院
25
固态发酵

固态发酵是以薯干粉、含淀粉的农副 产品为原料，配好培养基后，在常压 下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲， 装入曲盘，在一定温度和湿度条件下 发酵。

正烷烃氧化成脂肪酸 脂肪酸β氧化生成乙酸 与乙酸代谢途径相同完成柠檬酸合成
23:20:47
南京师范大学金女院
23
四、柠檬酸发酵工艺
（一）柠檬酸发酵用原料
柠檬酸发酵的原料有三大类
1.
糖质原料(甘蔗废糖蜜、甜菜废糖蜜)、
2.
淀粉质原料(主要是番薯、马铃薯、
木薯、玉米等)。 正烷烃类原料。
3.
则该酶失活或活性减少，而积累柠檬酸。添 加顺乌头酸酶抑制剂，如亚铁氰化钾（黄血 盐 ）可促进柠檬酸积累。
23:20:47
南京师范大学金女院
18
4.异柠檬酸脱氢酶

柠檬酸浓度升高到某一水平就抑制异柠 檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进了柠 檬酸自身积累
23:20:47
南京师范大学金女院
19
随着柠檬酸积累，pH降低到一定 程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸 脱氢酶失活(顺乌头酸酶、异柠檬 酸酶在pH2.0时失活)，更有利于柠 檬酸的积累及排出细胞外。
23:20:47 南京师范大学金女院 33
b、pH的影响
黑曲霉边糖化边产酸 菌体生长期pH：4.5左右 糖化适宜pH：3~4 产酸阶段pH ：2~2.5 在薯干粉的柠檬酸发酵中，初始pH（5.5）， 48h后pH会到达2.0，抑制糖化酶的作用。控制低 风量，减慢菌体生长，有充分时间糖化完全。
23:20:47
柠檬酸
0
23:20:46
主要内容
一、柠檬酸生产的历史 二、 柠檬酸发酵微生物 三、柠檬酸生物合成途径 四、柠檬酸发酵工艺 五、柠檬酸提取
23:20:46
南京师范大学金女院
1
柠檬酸

柠檬酸(Citric acid)，又名枸橼酸，分子式为 C6H8O7。外观为白色颗粒状或白色结晶粉末，无 臭，具有令人愉快的强烈的酸味，相对密度为 1.6550。柠檬酸易溶于水、酒精、不溶于醚、酯、 氯仿等有机溶剂。柠檬酸是生物体主要代谢产物 之一。
23:20:47
南京师范大学金女院
41

酸解 酸解是指柠檬酸钙与硫酸等强酸作用,在 强酸作用下使柠檬酸钙转变为柠核酸游离 出来，同时形成硫酸钙。由于后者的溶解 度极小，难溶于水而形成沉淀，从而达到 进一步的分离纯化作用。
23:20:47
南京师范大学金女院
42


净化 净化工艺包括脱色和离子交换树脂除去 杂质离子
23:20:47
南京师范大学金女院
36

提取柠檬酸的方法主要有钙盐法、离 子交换法、萃取法、电渗析法以及近 年来发展起来的色谱分离法；但目前 普遍使用的仍然是钙盐法。
23:20:47
南京师范大学金女院
37
钙盐法



柠檬酸的上清液中加人CaCO3或Ca(OH)2中和， 使柠檬酸生成柠檬酸钙沉淀 固液分离后，柠檬酸钙再用硫酸酸解，生 成柠檬酸水溶液 再经过脱色、去除阴、阳杂离子后得到提 取液进入浓缩、结晶工序得到纯柠檬酸固 体产品．
通过阳离于交换柱可除去Ca2+、Fe2+等阳离 子，最常用的阳离子交换树脂是732树脂。 如果柠檬酸液中含有较多的阴离子，可用阴 离子交换树脂除去。
23:20:47
南京师范大学金女院
43
结晶
南京师范大学金女院
34
c 、微量元素与柠檬酸发酵
Mg2+ 、Zn2+、 Mn2+、 Cu2+、 Fe2+和S、P、K、 Na等元素影响黑曲霉生长。

Mn2+参与黑曲霉的多种代谢， Mn2+既是异柠檬
酸脱氢酶和草酰乙酸酶的组成都分，又是TCA循环中 多种酶的激活剂，还参与蛋白、核酸的合成， Mn2+浓度高时，柠檬酸合成明显受影响，其作用远 甚于Fe2+ 。如前所述， Mn2+的不足可使细胞内 NH4+浓度升高．从而解除柠檬酸对酵解途径的抑制作 用。
南京师范大学金女院 15

23:20:47

积累柠檬酸要求在发酵过 程中培养基中Mn 2+浓度 要低， 导致NH 4+浓度升 高；侧系呼吸链，发酵时 不能缺氧。
23:20:47
南京师范大学金女院
16
2、丙酮酸羧化酶：组成型酶，不被调节控制。 就源源不断地提供草酰乙酸。 3、柠檬酸合成酶：柠檬酸合成酶是TCA循环第 一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。
烷烃
23:20:46 南京师范大学金女院 9
葡萄糖为碳源

糖经EMP、HMP途径形成丙酮酸。
黑曲霉生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径， 前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1
磷酸果糖激酶
23:20:46
南京师范大学金女院
10

丙酮酸生成草酰乙酸和乙酰CoA
丙酮酸经CO2固定生成草酰乙酸（丙酮酸羧化酶）
23:20:47
南京师范大学金女院
35
五、柠檬酸的提取工艺

发酵液中除含柠檬酸外，还含有黑曲霉菌丝 体及自溶物、原料残渣(主要是纤维素)、未利 用的还原糖、非发酵性糖以及发酵过程产生的 色素及其他有机酸等。
我国在提取率、机械化程度和劳动生产率 等方面比较落后，因而在国内研究从发酵 液中高效、低能耗地提取柠檬酸是一个极 有意义的课题．
23:20:47
南京师范大学金女院
14


NADH被氧化了，又没有产生ATP。
为了解释这种现象，有人提出了一种假设： 菌体内存在一条侧系呼吸链 实验证明，某些微生物体内确实存在侧系 呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧， 如在柠檬酸的发酵中，发酵液的溶氧浓度 在很低水平维持一段时间，或中断供氧一 段时间（20分钟），则这一侧系呼吸链不 可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而 是产生了大量的菌体。
乙酰CoA
草酰乙酸 柠檬酸合成酶
柠檬酸
顺乌头酸酶
顺乌头酸 α-酮戊二酸 异柠檬酸
异柠檬酸脱氢酶
23:20:47 南京师范大学金女院 13
1、磷酸果糖激酶（PFK） NH4+激活PFK的活性，ATP抑制PFK活性。

研究表明，柠檬酸产生菌——黑曲霉如果生 长在Mn+缺乏的培养基中，NH4+浓度异常的高，可 达到25mmol/L，显然，由于Mn+的缺乏，使得微生 物体内NH4+浓度升高，使得葡萄糖源源不断的合 成大量的柠檬酸。
1938 年 Perquin 和 1942 年 Karrow 进行了柠檬酸的 深层 发酵研究。 1951年美国Miles公司首先以淀粉质为原料，经水解后 深层发酵大规模生产柠檬酸。
23:20:46 南京师范大学金女院 3

我国1966年后，天津市工业微生物研究所、 上海市工业微生物研究所相继开展用黑曲霉 进行薯干粉原料深层发酵柠檬酸的试验研究，
南京师范大学金女院
28
种子制备
①斜面种子培养：斜面培养基为10-12。Bx的麦 芽汁或米曲汁，也可采用20％马铃薯煮出汁琼 脂培养基，33—35℃培养4—5d，至斜面长满 孢子即可。
23:20:47
南京师范大学金女院
29

②麸曲制备。用1000ml角烧瓶装麸皮40g左右。 麸曲的含水量要合适，一般控制在60％一65％ 左右，麸曲种子的培养温度约34℃．培养1天 后要“敲瓶”一次，使之上下翻动。
23:20:47
南京师范大学金女院
20
黑曲霉利用糖类为原料生产柠
檬酸时，柠檬酸如何积累？
23:20:47
南京师范大学金女院
21
乙酸为碳源
乙酰CoA 草酰乙酸 乙酸
苹果酸乙酰CoA乙醛酸
柠檬酸
延胡索酸
乙酸
异柠檬酸
琥珀酸
23:20:47
TCA循环 乙醛酸循环
22
南京师范大学金女院
正烷烃为碳源
假丝酵母属
23:20:47
南京师范大学金女院
26
液态浅盘发酵

液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生 产方法是将灭菌的培养液通过管道转 入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌 体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。发 酵时要求在发酵室内通入无菌空气。
23:20:47
南京师范大学金女院
27
以薯干为原料液体深层发酵法
23:20:47
23:20:46
南京师范大学金女院
2
一、柠檬酸生产的历史
柠檬酸1784年由Scheels从柠檬中提取发现。 1893年前，主要用柑橘、菠萝果实提取柠檬酸。 1893年德国微生物学家 Wehmer 发现二种青霉菌可以生 成柠檬酸。 1917年Currie使用黑曲霉浅盘发酵生产柠檬酸。
1923年美国科学家研究成功了以废糖蜜为原料的 浅盘 法柠檬酸发酵，并在比利时设厂生产。