4.4分析方法的验证
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第四节 分析方法的验证
药品质量标准分析方法验证
目的
证明采用的方法适用于相应检测要求
在建立药品质量标准时，分析方法需经验证后 方能最终确定；
在药品生产工艺变更、制剂的组分改变、原分 析方法进行修订时，质量标准分析方法也需进 行验证，验证过程也称为方法再验证，再验证 的内容可以全面验证或部分验证。
目视法：非仪器分析的方法采用目视法确定检测限。 即用已知浓度的被测物，试验出可能被检出的最低 浓度或最低量。
信噪比法：对能显示基线噪音的仪器分析方法，可 将已知低浓度的被测组分溶液与空白样品的测定结 果进行比较，按信噪比（S/N）确定可被检出的最 低浓度。一般信噪比为3：1（S/N=3）或2：1时 相应的浓度或注入仪器的量确定检测限；
常采用强制破坏试验， 考察药物与降解产物的分离度； 如方法不够专属， 应采用多个方法予以补充。
强制破坏试验
检测限（LOD）
是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量。 LOD是一种限度检查效能指标，它反应方法是
否具有灵敏的检测能力，即是否具备足够的灵 敏度。它无需准确定量。
检测限（LOD）的方法
线性
两个参数是否有线性关系需要通过试验来确定。 考察的方法是配制一系列不同浓度的测定组分溶 液（至少5份），分别测定其响应值，用最小二乘 法以响应值对浓度进行线性回归，即可计算出相 关系数r和a、b的值。相关系数r接近于1，说明线 性关系好。
线性
8.E+0 6
6.E+0 6
4.E+0 6
2.E+0 6
在建立分析方法时，应对以上条件进行试验，以 考察方法的耐用性；
方法验证示例——HPLC法检查阿 司匹林游离水杨酸
准确度 精密度
专属性 定量限
线性范围、 耐用性
采用 合适
方法验证示例——HPLC法检查阿 司匹林游离水杨酸
专属性：通过分离测定阿司匹林、阿 司匹林混合水杨酸，合成粗品，阿司 匹林的高温、强酸、强碱、氧化降解 产物，验证方法的专属性。
方法验证的目的 01
方法验证的项目
02
添加标题
方法验证的内容
03 添加标题
是指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品， 经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
一般用标准偏差（s或SD）或相对标准偏差 （RSD）表示，其内容包括重复性、中间精密 度和重现性。
精密度
1
重复性 在相同的操作 条件下，由同 一人连续测定 所得结果的精 密度，也称批 内精密度或日
内精密度
2
中间精密度
例如， 做鉴别试验和 杂质限度检查 就没必要进行 准确度的验证； 而对于耐用性， 不论鉴别、检 查还是含量测 定都需要进行 验证。
准确度
是指用该方法测定结果与真实值或参考值接近 的程度
一般用回收率（%）表示 一般在规定范围内，分别配制浓度为80%、
100%、120%的供试品溶液各3份，测定其含 量，将实测值与理论值比较，计算回收率。
方法验证示例——HPLC法检查阿 司匹林游离水杨酸
准确度与精密度：
根据水杨酸峰面积，按标准溶液加入法，计算水 杨酸的回收率（即为准确度）、相对标准偏差 （RSD，即为重复性）；
另由不同人员于不同时间使用不同仪器测定，测 得RSD即为中间精密度。
准确度验证
标准添加水杨酸 阿司匹林
方法验证示例——HPLC法检查阿 司匹林游离水杨酸
同一个实验室， 不同时间，不 同人用不同设 备测定所得结 果之间的精密 度。（实验室 内部条件改变）
3
重现性
不同实验室， 不同人测定结 果之间的精密 度。法定标准 采用的分析方 法，应进行重 现性试验。
专属性
是指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等） 可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物 的特性。
按水杨酸峰计算，理论板数、分离度、拖尾因子 均应符合规定的要求；
拟定水杨酸对照品溶液浓度的范围为8~12µg/ml， 制成4、8、10、12、16、20µg/ml系列水杨酸标 准溶液，验证峰面积与浓度的线性，符合要求。
方法验证示例——HPLC法检查阿 司匹林游离水杨酸
准确度与精密度：
取阿司匹林对照品9份，每份0.1g，分置10ml量 瓶中，分别精密加入水杨酸对照品各3份配制溶 液，相当于水杨酸限度的80%、100%和120%， 照拟定方法测定。
药品质量标准分析方法验证
验证项目
鉴别试验 杂质检查 原料药或制剂中有效成分含量测定 制剂中其他成分（如防腐剂）的测定 溶出度检查中溶出量的测试方法
药品质量标准分析方法验证
验证内容
准确度 精密度 专属性 检测限
定量限
线性
范围耐用性Fra bibliotek药品质量标准分析方法验证
验证内容
①已有重现性验证，不需验证中间精密度 ②如一种方法不够专属，可用其他分析方法补充 ③视具体情况予以验证
定量限（LOQ）
是指试样中被测物能被定量测定的最低量，其 测定结果应具有一定准确度和精密度。
常用信噪比确定定量限，一般以信噪比（S/N=10）为 10：1时相应的浓度或注入仪器的量来确定定量限。
线性与范围
范围是指能达到一定精密度、准确度和线性、 测试方法适用的高低限浓度或量的区间；
线性是指在设计的“范围”内，测试结果（响 应值）与试样中被测物浓度直接呈正比关系的 程度；
定量限：通过配制不同浓度的水杨酸 溶液，进样分析，以信噪比（S/N） 为10时的浓度1µg/ml作为定量限。
方法验证示例——HPLC法检查阿 司匹林游离水杨酸
线性与范围：
以定量限的10倍浓度，即10µg/ml作为水杨酸对 照品溶液，则以水杨酸限度为0.1%计算，应制成 10mg/ml的阿司匹林供试品溶液。
耐用性：
取含水杨酸的阿司匹林对照品、合成粗品及降解 产物溶液，改变色谱条件并于不同时间进样分析， 验证方法耐用性。
考察色谱条件如流动相中乙腈、四氢呋喃和冰醋 酸的比例、流动相流速、柱温等对阿司匹林与水 杨酸及其他杂质或降解产物的分离度，以及水杨 酸的测定值的准确度和精密度。
简单回顾
添加标题
0.E+0
0
0
y = 55949x + 25494 R2 = 0.9992
50
100
150
C (ug/ml)
耐用性
是指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响 的承受程度；
典型的变动因素有样品溶液的稳定性，样品提取 的次数和时间；液相色谱流动相中溶剂的比例和 PH值，不同厂牌、不同批号同类型的色谱柱， 柱温，流速等；
准确度测定
制剂的含量测定方法一般用回收试验来考察。将已 知量的测定组分加入到处方比例的附加剂中，用验 证的方法进行测定，根据测定结果计算回收率。
准确度测定
如不能得到制剂的全部组分，也可将已知量的测定 组分加入一定量已知含量的样品中，照验证方法测 定，根据测定结果按下式计算回收率：
精密度
药品质量标准分析方法验证
目的
证明采用的方法适用于相应检测要求
在建立药品质量标准时，分析方法需经验证后 方能最终确定；
在药品生产工艺变更、制剂的组分改变、原分 析方法进行修订时，质量标准分析方法也需进 行验证，验证过程也称为方法再验证，再验证 的内容可以全面验证或部分验证。
目视法：非仪器分析的方法采用目视法确定检测限。 即用已知浓度的被测物，试验出可能被检出的最低 浓度或最低量。
信噪比法：对能显示基线噪音的仪器分析方法，可 将已知低浓度的被测组分溶液与空白样品的测定结 果进行比较，按信噪比（S/N）确定可被检出的最 低浓度。一般信噪比为3：1（S/N=3）或2：1时 相应的浓度或注入仪器的量确定检测限；
常采用强制破坏试验， 考察药物与降解产物的分离度； 如方法不够专属， 应采用多个方法予以补充。
强制破坏试验
检测限（LOD）
是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量。 LOD是一种限度检查效能指标，它反应方法是
否具有灵敏的检测能力，即是否具备足够的灵 敏度。它无需准确定量。
检测限（LOD）的方法
线性
两个参数是否有线性关系需要通过试验来确定。 考察的方法是配制一系列不同浓度的测定组分溶 液（至少5份），分别测定其响应值，用最小二乘 法以响应值对浓度进行线性回归，即可计算出相 关系数r和a、b的值。相关系数r接近于1，说明线 性关系好。
线性
8.E+0 6
6.E+0 6
4.E+0 6
2.E+0 6
在建立分析方法时，应对以上条件进行试验，以 考察方法的耐用性；
方法验证示例——HPLC法检查阿 司匹林游离水杨酸
准确度 精密度
专属性 定量限
线性范围、 耐用性
采用 合适
方法验证示例——HPLC法检查阿 司匹林游离水杨酸
专属性：通过分离测定阿司匹林、阿 司匹林混合水杨酸，合成粗品，阿司 匹林的高温、强酸、强碱、氧化降解 产物，验证方法的专属性。
方法验证的目的 01
方法验证的项目
02
添加标题
方法验证的内容
03 添加标题
是指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品， 经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
一般用标准偏差（s或SD）或相对标准偏差 （RSD）表示，其内容包括重复性、中间精密 度和重现性。
精密度
1
重复性 在相同的操作 条件下，由同 一人连续测定 所得结果的精 密度，也称批 内精密度或日
内精密度
2
中间精密度
例如， 做鉴别试验和 杂质限度检查 就没必要进行 准确度的验证； 而对于耐用性， 不论鉴别、检 查还是含量测 定都需要进行 验证。
准确度
是指用该方法测定结果与真实值或参考值接近 的程度
一般用回收率（%）表示 一般在规定范围内，分别配制浓度为80%、
100%、120%的供试品溶液各3份，测定其含 量，将实测值与理论值比较，计算回收率。
方法验证示例——HPLC法检查阿 司匹林游离水杨酸
准确度与精密度：
根据水杨酸峰面积，按标准溶液加入法，计算水 杨酸的回收率（即为准确度）、相对标准偏差 （RSD，即为重复性）；
另由不同人员于不同时间使用不同仪器测定，测 得RSD即为中间精密度。
准确度验证
标准添加水杨酸 阿司匹林
方法验证示例——HPLC法检查阿 司匹林游离水杨酸
同一个实验室， 不同时间，不 同人用不同设 备测定所得结 果之间的精密 度。（实验室 内部条件改变）
3
重现性
不同实验室， 不同人测定结 果之间的精密 度。法定标准 采用的分析方 法，应进行重 现性试验。
专属性
是指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等） 可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物 的特性。
按水杨酸峰计算，理论板数、分离度、拖尾因子 均应符合规定的要求；
拟定水杨酸对照品溶液浓度的范围为8~12µg/ml， 制成4、8、10、12、16、20µg/ml系列水杨酸标 准溶液，验证峰面积与浓度的线性，符合要求。
方法验证示例——HPLC法检查阿 司匹林游离水杨酸
准确度与精密度：
取阿司匹林对照品9份，每份0.1g，分置10ml量 瓶中，分别精密加入水杨酸对照品各3份配制溶 液，相当于水杨酸限度的80%、100%和120%， 照拟定方法测定。
药品质量标准分析方法验证
验证项目
鉴别试验 杂质检查 原料药或制剂中有效成分含量测定 制剂中其他成分（如防腐剂）的测定 溶出度检查中溶出量的测试方法
药品质量标准分析方法验证
验证内容
准确度 精密度 专属性 检测限
定量限
线性
范围耐用性Fra bibliotek药品质量标准分析方法验证
验证内容
①已有重现性验证，不需验证中间精密度 ②如一种方法不够专属，可用其他分析方法补充 ③视具体情况予以验证
定量限（LOQ）
是指试样中被测物能被定量测定的最低量，其 测定结果应具有一定准确度和精密度。
常用信噪比确定定量限，一般以信噪比（S/N=10）为 10：1时相应的浓度或注入仪器的量来确定定量限。
线性与范围
范围是指能达到一定精密度、准确度和线性、 测试方法适用的高低限浓度或量的区间；
线性是指在设计的“范围”内，测试结果（响 应值）与试样中被测物浓度直接呈正比关系的 程度；
定量限：通过配制不同浓度的水杨酸 溶液，进样分析，以信噪比（S/N） 为10时的浓度1µg/ml作为定量限。
方法验证示例——HPLC法检查阿 司匹林游离水杨酸
线性与范围：
以定量限的10倍浓度，即10µg/ml作为水杨酸对 照品溶液，则以水杨酸限度为0.1%计算，应制成 10mg/ml的阿司匹林供试品溶液。
耐用性：
取含水杨酸的阿司匹林对照品、合成粗品及降解 产物溶液，改变色谱条件并于不同时间进样分析， 验证方法耐用性。
考察色谱条件如流动相中乙腈、四氢呋喃和冰醋 酸的比例、流动相流速、柱温等对阿司匹林与水 杨酸及其他杂质或降解产物的分离度，以及水杨 酸的测定值的准确度和精密度。
简单回顾
添加标题
0.E+0
0
0
y = 55949x + 25494 R2 = 0.9992
50
100
150
C (ug/ml)
耐用性
是指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响 的承受程度；
典型的变动因素有样品溶液的稳定性，样品提取 的次数和时间；液相色谱流动相中溶剂的比例和 PH值，不同厂牌、不同批号同类型的色谱柱， 柱温，流速等；
准确度测定
制剂的含量测定方法一般用回收试验来考察。将已 知量的测定组分加入到处方比例的附加剂中，用验 证的方法进行测定，根据测定结果计算回收率。
准确度测定
如不能得到制剂的全部组分，也可将已知量的测定 组分加入一定量已知含量的样品中，照验证方法测 定，根据测定结果按下式计算回收率：
精密度