上海地区种猪场健康猪群猪链球菌监测及血清分型研究

409
10-F
CTATCACTACCACGGAATGC
10-R
TAACCGTCCGTCTAGAATGT
808
11-F
GTATGTGTTGATTTGGTTAGGC
11-R
CCTTGTTCCCTCATTCAAGTAA
424
12-F
AACAGGTATTTCAGGATTGCTT
12-R
AGTGCCAAGTTTCAAATATCCT
CGATCTGAGGACTTATCAAGAA
815
CGTATTTGCAGTTGTATCGTTT
ATTGAGATAAACTACTCCGTGC
888
GTCTATTTAGGCCGACTTCTTT
GAATGCTACTGCTATCAATCCT
490
AAAGTGCCTATTCTGGGATTTT
TAAAGGCAACTTCCACATTGTA
•调查研究！
《上海畜牧兽医通讯》2021年第3期
1. 2. 2 猪链球菌的分离与鉴定
1.2.4 血清凝集实验
用一次性接种环蘸取口液样本，划线接种哥
取2 mL菌液滴于玻片上，滴加15 mL生理盐
伦比亚血琼脂培养基，置于5% CO2恒温培养箱 水，静置1 min,观察是否发生自身凝集。取2 mL
中，36 =培养24〜4< h；每份样品挑取3〜5个可 菌液滴于玻片上，向菌液中加入15 mL标准阳性血
GCAGCGTATTCTGTCAAACG
689
17-R ATCTGACGGTAAATGTTCTCTG
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
18-F ATAGGCTGTACTTTGATAACCG
GGTTACCTTGTTACGACTT
1 500
18-R AGCCTATCGCTCAAAAACTTAT
TCAATTCCGTTAATCTTTGCAC
19-F TATTGAAACATTGGTGTTGCTG
AGCCAAAATTTCATGGTAAAGC
146
19-R AACAATACTTGATTTGCGACAC
TTCGTATTAACTTACTTGGCGT
20-F TAGGAATAATCGGGTTGCTTTT
TAAATCCCCATATGCCAAATCC
引物
gdh-F # gdh-R #
16S-F# 16S-R# 1&14-F 1&14-R
2&1/2-F
2&1/2-R 3-F 3-R 4-F
表1二重PCR鉴定引物及血清型分型检测引物
序列#' + 3g
目的片段长度/\p 引物
序列#' + 3g
CCATGGACAGATAAAGATGG
17-F TTGCCGTATAAGGTCTTAGTTG
能感染人，其中2型为报道最多的血清型，无论对
猪，还是对人都存在较大的安全威胁％
为调查上海市健康种猪猪群中猪链球菌携带
情况，掌握猪链球菌血清型分布情况，采集8家规模
化种猪场猪只的口液样品，开展猪链球菌分离、鉴定
与血清分型研究工作％本研究为上海市种猪场猪链
球菌病的防控，病原优势血清型的疫苗研发，以及人
畜公共卫生安全隐患排查工作的开展提供参考％
特异性的引物进行PCR扩增％反应体系:PCR预 133 株。
混液12. 5 mL9 ddH2 O 8. 5 “，上、下游引物各
同一样品来源的菌株合并处理后，开展双重
1 mL^DNA模板2 mL0反应条件:94 =预变性 PCR鉴定。鉴定结果：86份口液样本鉴定为猪链球
5 min；94 =变性 30 s,55 =退火 30 s,72 =延伸 菌阳性，阳性率58. 11%(86/148),部分口液样本双
228
注：表中标有“井”的引物为鉴定引物，其他为血清型分型检测引物&
1.1.8 主要试剂 哥伦比亚基础培养基购自北京陆桥技术有限公
司，无菌脱纤维羊血购自源叶生物科技有限公司，革 兰染液购自珠海贝索生物技术有限公司，MS蛋白质 谱基质液购自生物梅里埃公司,2C'q酶PCR预混 液购自宝生物工程（大连）有限公司，猪链球菌88个 血清型验证血清购自丹麦Statens Serum Instituteo
268
ATGGGGACTTCTTTAATTGCTT
CGATTAGATAAGCGCATTTGTT
805
CCGCTACTACATAGTTCAGATG
ATGCACTTGTTGTATCCTCTAC
298
ATTTGGCTATTTGCTTCACTTG
TTAGCTGTCCCCTTAGAAAATG
877
1.2方法 1.2.1 口液采集
为了提高鉴定效率、增加准确性，本研究选用
循环；72 =延伸10 min。将反应产物进行1%琼 蛋白质谱结合双重PCR手段进行猪链球菌的快速
脂糖凝胶电泳后拍照％
鉴定。其中94份样品经蛋白质质谱初步鉴定为猪
1.2.3 菌株血清型分析
链球菌阳性，蛋白质质谱鉴定阳性率63. 51% (94/
将鉴定为猪链球菌阳性的菌株，用33个血清型 148)。共培养鉴定出链球菌或链球菌属的菌株
22-F AGGATCGGTAAGTTTAGGTACA
目的片段长度/\p 380 310 381 212 189
基金项目：上海市科技兴农重点攻关项目［沪农科攻字（2016）第6-2-1号］ 作者简介：陆亚男（1984-）,女，本科，助理畜牧师，主要从事畜牧技术推广工作% % 通信作者，E-m）：sca2cbio@163. com
229
7-F
GTGCTGGATTAATTACGTTGAG
7-R
ACATTTTGCTGCCATTTCTTAG
408
8-F
ATCGCTTCAAATAAGGTAGGAG
8-R
TGTAGGCCGTAATATCAACAAA
268
9-F
TCCCTTTAATTTCACAGGCAAT
9-R
CTGTCAAAGAATTGAATCCCAC
15 s,循环30次；最后72 =延伸10 min。将反应产 重PCR扩增结果如图2所示。各种猪场采集样品
物进行1%琼脂糖凝胶电泳并拍照。
数及样品猪链球菌阳性率见表2。
10 1 1 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
2 000
1 500 JJP 1 000 bp
猪链球菌是畜牧养殖业重要的病原微生物之
一，呈全球分布，在我国广泛存在于猪场，给我国的 养猪业造成了重大的经济损失％猪链球菌病可引
起猪只脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、支气管
炎等临床症状，发病猪群的猪只发病率可达 80%*1+%与此同时，猪链球菌也是一种重要的人兽 共患病病原*2%我国1998年,2004年先后于江苏 和四川两地报道人感染猪链球菌病例［34］，此后，猪 链球菌的研究得到广泛关注％根据荚膜多糖抗原 成分，猪链球菌可分为33个血清型（1-31,33及1/ 2型）5+ ,1型、2型、7型、9型通常被认为是优势血 清型，而2、4、5、9、14、16、21、24型等多种血清型均
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《上海畜牧兽医通讯》2021年第8期
表2不同猪场口液样品数及猪链球菌阳性率
样品来源 样品数/份 阳性样品数/份
阳性率/%
A猪场
55
40
72. 73
B猪场
20
10
50.00
C猪场
15
12
80.00
D猪场
19
10
52.63
E猪场
19
3
15.79
F猪场
10
4
40.00
G猪场
5
5
100.00
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
H猪场
疑单菌落，参照文献进行蛋白质谱鉴定；挑取 清，充分混匀，观察有无凝集现象。同时设立生理
蛋白质质谱鉴定为猪链球菌或链球菌属的菌落, 盐水作阴性对照。
按初次分离培养条件进行纯培养％刮取纯培养细 菌，米用热裂解法提取DNA；米用gdh-16S双重
2结果与分析
PCR鉴定方法进行鉴定％ PCR反应体系(25 mL)： 2XPCR预混液12. 5宀，两对上、下游引物各
158
TATTATAGTCCGATGCAAGCAG
ATGAGAACGAAACGGAATAGTT
461
GATAGCAATGTAATCCAATCGC
GTAGGTTCCCCTAGTAAGAAGT
204
ATTGAGTCCTTTTACTGGTAGC
TACTGAGCTACATAATCCCACA
890
CAAAATTCCTGGATTAACGCTT
•调查研究！
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上海地区种猪场健康猪群猪链球菌监测及血清分型研究
陆亚男，王晓旭，徐 锋，沈莉萍，朱九超，王 建
（上海市动物疫病预防控制中心，上海201103）
摘 要：为了解上海地区种猪场猪群猪链球菌流行情况、血清型分布情况，于2020年5月，从上海8家规模化种猪 场采集猪口液样品148份，开展猪链球菌监测及血清型分型研究％ 86份口液样品鉴定为猪链球菌阳性，阳性率 5& 11% % 86株猪链球菌分离株中，49株鉴定为传统血清型，血清型鉴定率56. 98% ；共鉴定出12种血清型，其中优 势血清型为猪链球菌7型（42.86%）,其次为12型（20.41% ）,1型和2型猪链球菌各检出1株，9型未检出%本次调 查结果提示，上海地区健康猪群携带的1型、2型,7型猪链球菌可能成为感染人和猪群的风险因素％ 关键词：猪链球菌；种猪；健康猪群；血清型；PCR分型
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引物 22-R 28-F 28-R 24-F 24-R 25-F 25-R 26-F 26-R 27-F 27-R 28-F 28-R 29-F 29-R 80-F 80-R 81-F 81-R 88-F 88-R
序列（5' + 8‘）
续表 目的片段长度
ATGCAGTAAAACACGAAAACAA
892
18-F
AACGAACATATTGGAATGTTGC
18-R
AAATCAAAACACACCACTTAGC
839
15-F
ACCTACTCAAGAACATCCTTTC
15-R
GTAACTAAAACAGCAAACGTCA
458
16-F
ATCAACAAACATTTTCGAGGAC
16-R GCTGAATAATAGATTCGTCCTGT
・34・
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引物
序列（5' + 8‘）
目的片段长度
4-R
CAAACCATGTTTTCTCCTTAGC
187
5-F
AGGTATGTCTTCTTATTCGCAG
5-R
ATAATCCCTCCTGATACTAGGC
428
6-F
ACAGGAAGAGGTATCAATCAGT
6-R
CTGAACCATTTGGGATAAAGGA
1材料和方法
1.1材料 1.1.1 样本及来源
口液样品采自上海市8家规模化种猪场（A〜 H）,共计148份％样品采集时间为2020年5月% 33个血清型的猪链球菌阳性菌株由南京农业大学 惠赠％ 1.1.2 引物序列
猪链球菌鉴定引物（gd316S）及分型引物序列 参照文献［6-7］设计，序列见表1,引物由上海生工 生物科技有限公司合成％
5
2
40.00
2.2猪链球菌分离株血清型分型结果 对86株猪链球菌进行PCR分型鉴定，结果显
示：其中49株为传统血清型，血清型鉴定率为 56.98% %共鉴定出12种血清型，其中优势血清型 为猪链球菌7型，共计21株(42. 86%)；其次为 12型，10株(20. 41%)；其他10种血清型共18株, 总占比约37% %分离株血清型分布情况如图8 所示％
使用棉绳采集猪的口液％可在猪只进食前，将 棉绳系于猪舍围栏上，棉绳两端各保留80〜40 cm， 以便猪只自由咀嚼，待口液浸润棉绳后，用封口袋 收集棉绳，在封口袋的下角剪个小口，用15 mL离 心管收集口液％采样操作如图1所示。
a ：系棉绳；\ ：收集棉绳；c ：收集口液
图1猪口液采样操作演示图
・85・
750 bp 500 bp 250 bp 100 bp
约 1 500 bp -约689 bp
2 000
1 500 JJP bp 1 000
750 bp 500 bp 250 bp 100 bp
M: DNA Marker； 1 〜24：样品 图2部分口液样品的猪链球菌PCR扩增电泳图谱
・36・
一约 1 500 bp 约689 bp
363
20-R AAGCGCTATATAAGGAAACCTC
ACATCCATTGCAGGAGTAGT
21-F AGTGATAGTTTGAAAGAGCGTA
TGCAGTTCCAAAATTCTTCGT
210
21-R ATAAATTCTGCTGATAGACCCC
ACACTTGTTGATTTTGACGATT
2.1 猪只口液猪链球菌分离鉴定情况 口液样本经分离培养，在哥伦比亚血平板上见
0. 5 mL9DNA 模板 2 ",灭菌蒸 # 水 8. 5 mL0
圆形微凸、表面光滑、湿润、灰白色菌落，菌落直径
PCR反应条件：94 =预变性5 min； 94 =变性 1〜2 Mm$或$溶血,为疑似猪链球菌菌落。
30 s,56 =退火30 s,72 =延伸1 min,扩增30个