碱性磷酸酶Km值的测定

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Vmax•[S] V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数, Vmax为最大反应速度,
当V=Vmax/2时,则Km=[s]。 Km是酶的特征常数,测定Km是研究酶 的一种方法
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将米氏方程变形为双倒数方程,以l/ v-1/[s]作图,将各点连线,在横轴 截距为-/km,据此可算出Km值。
1/V=Km/ Vmax•[S] + 1/ Vmax
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本实验以碱性磷酸酶为例,用磷酸苯二钠为其 底物,生成酚和磷酸,酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用,经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物,根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下:
磷酸苯二钠+H2O 酚
AKP OH-

苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物
OD510
1/OD510
VMAX
1/2VMAX
Km
底物浓度与反应速度关系曲线
1/Vmax
[S]
-1/Km
双倒数曲线
1/[s]
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【实验讨论】
比较两个值的大小,分析实验误差产 生的原因
比较两种Km测定方法各自的优缺点
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6
78
12
16
0
1/[S] 1/OD
1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 -
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2、作图
以 [s]为横轴,OD510为纵横作图,观 察曲线形状;查Km 值
以1/[s]为横轴,1/OD510为纵轴 作图,观察曲线形状;查Km 值
比较两个值的差异.
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碱性磷酸酶Km值的 测定
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【实验目的】
1.了解酶的Km值测定原理和方法
2.掌握碱性磷酸酶(AKP)活性测 定的原理和方法
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【实验原理】
在温度,PH及酶浓度恒定的条件下,酶促 反应的初速度随底物浓度(S)增大而增加, 但当底物浓度增大到一定极限时,则反应 速度趋于恒定,此最大反应速度Vmax,反 应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方 程来表示,即:
磷酸苯二钠h2oakpoh苯酚苯酚4氨基安替比林k3fecn6醌衍生物红色光密度与颜色颜色与酚酚与酶活性成正比故以1a取代1v作为纵坐标作图004m40mm磷酸苯二钠溶液底物液碳酸盐缓冲液ph100005mgml碱性磷酸酶溶液ap05铁氰化钾实验试剂实验操作底物液40mm碳酸缓液ph10蒸馏水005015025030040060080000090090090090090090090090095085075070060040020100混匀后37水浴预温5分钟左右010101010101010101010101010101013715碱性溶液10101010101010104氨基安铁氰化钾10101010101010102020202020202020混匀室温放置10分钟左右空白于5l0nm比色记录各管的光密度实验结果结果记录结果记录odod底物浓度mmoll1216033302000167012500830063od510km2作图
4-氨基安 替比林
铁氰化钾
1.0 1.0 2.0 2.0
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
混匀,室温放置10分钟左右, 以8号管
为空白,于5l0nm比色,记录各管的光密 度
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【实验结果】
1、原始数据
结果记录 1 2 3 4
5
OD
底物浓度 1 3 5 6 8 mmol/L
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【实验操作】
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00
(0.04M)
ห้องสมุดไป่ตู้
碳酸缓 液(pH=10)
0.90 0.90
0.90 0.90
0.90
0.90 0.90
0.90
蒸馏水 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.00
混匀后37℃水浴,预温5分钟左右
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酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
加入酶液后立即混匀(保持37℃水浴), 反应开始。 从加入酶液起计时至下一步 加入碱性 溶液停止反应,各管反应时间应准确一 致,为15分钟。
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碱性溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
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