结核杆菌对利福平药物的敏感性试验(一)(精)

结核杆菌对利福平药物的敏感性试验(一)
【摘要】目的分析结核分枝杆菌对利福平的耐药现况，为结核病的防治提供依据。

方法采用直接涂片检查法和培养法,对肺结核病人的痰液进行检查，阳性标本经抗酸染色镜检确认后，采用绝对浓度法的间接法进行耐药性测定。

结果 131例疑似肺结核病人痰标本中，直接涂片法检出阳性标本21例，阳性检
出率为16.0%（21/131）；培养法共检出阳性标本56例，阳性检出率为42.7%（56/131）。

比较两种检测方法的阳性检出率，差异有显著性（P0.05）。

培养法高于直接涂片法。

将培养阳性标本进行利福平药物敏感性试验，其中有17株发生耐药，耐药率为30.4%（17/56）。

结论结核杆菌对利福平的初始耐药率
仍处在较高水平，必须进一步加强对耐药结核杆菌的监控。

【关键词】结核分枝杆菌福平药敏试验
Study on the primary drug resistance against rifampicin for tubercolusis
ZHANG Sheng, CHEN Si dong, WANG Bao guo，ZHOU Yong,ZHOU
Wei ping
(Institute of Disease Prevent and Control of Songgang
Town,Shenzhen 518105; Guangdong College of
Pharmacy,Guangzhou,Guangdong 510006,China)
Abstract:Objective To study the situation and trend of rifampicin resistance for tuberculosis and provide the basis for tuberculosis prevention and treatment. Methods Sputum fluid is examined with
direct smear and culture on modified Lowenstein-Jensen medium after treatment with 4% NaOH. Then the positive samples were subjected to susceptibility testing against rifampicin using absolute concentration method. Results The positive rate with culturing and smearing method was 42.7%（56/131）,and the positive rate with direct smearing method was16.0%（21/131）. The preva lence rate of primary drug resistance was 30.4%(17/56). Conclusion The rate of primary drug against rifampicin is still at a higher level. Monitoring of the resistance of tuberculosis should be strengthened.
Key words: mycobacterium tuberculosis; rifampicin; drug resistance test
结核病是我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题,世界卫生组织已将结核病作为重点控制的传染病之一。

全球80%的结核患者分布在22 个结核病高负担国家,中国是其中之一,结核患者人数仅次于
印度居世界第二位〔1〕。

但是，近10年来,临床上发现抗结核药的耐药性对结核病化疗效果的影响日益严重,尤其是利福平耐药的发生率不断上升给抗结核治疗带来较大的困难。

为了解结核杆菌对利福平耐药的状况，为临床合理、联合用药提供依据，特作本研究。

结果报告如下。

1 材料与方法
1.1 病例来源
2005年11月～2006年5月，在广州市白云区某医院、深圳市宝安区某医院检查首次确诊为肺结核的病人，共131例。

病例发病前均未服用过抗结核药物。

结核分枝杆菌参考菌株为H37Rv敏感株，由中国结核病防治临床中心国家参比实验室提供。

1.2 痰液直接涂片检查
用接种环取脓性痰液1～2环，均匀涂于载玻片上，待自然干燥，微火焰固定，经抗酸染色后镜检。

1.3 分枝杆菌培养
1.3.1 培养基
为酸性罗氏培养基。

成分：谷氨酸钠(纯度95%以上) 7.2 g,KH2PO4 14 g,MgSO4·7H2O 0.24 g,枸橼酸镁 0.6 g,甘油12 mL,蒸馏水600 mL,马铃薯淀粉 30 g,新鲜鸡卵液1 000 mL,2%孔雀绿水溶液 20 mL。

1.3.2 制备方法
各盐类成分溶解后，加马铃薯淀粉，混匀，沸水浴煮沸1 h呈糊状(不时摇动，防凝块)，待冷后，加经消毒纱布过滤的新鲜鸡卵液，混匀，再加入2%孔雀绿水溶液，混匀，分装于经121 ℃高压灭菌的中型试管，每管加培养基约7 mL，斜置血清凝固器内1～2层，斜面高度占试管2/3,90 ℃ 1.5 h或85 ℃ 1 h间歇2次。

冷却后，37 ℃无菌试验24 h。

培养基斜面颜色鲜艳，表面光滑无泡，有一定韧性和酸碱缓冲能力,4 ℃保存，1个月内使用。

1.3.3 接种方法
取痰标本1～2 mL，加入2倍量4%NaOH，于室温下放置30 min（期间振荡2～3次）后，取处理消化后痰液0.1 mL，无菌操作接种于培养基斜面上，每份标本同时接种2支酸性改良罗氏培养基，放置37 ℃恒温箱培养。

每周观察1次,记录细菌生长情况，至8周为止。

1.4 药敏试验
具体操作参照结核病诊断细菌学检验规程〔2〕。

1.4.1 药物
利福平由美国Sigma公司生产，北京索莱宝科技有限公司提供。

为纯品，粉剂。

1.4.2 培养基
改良罗氏培养基。

成分：谷氨酸钠(纯度95%以上) 7.2 g,KH2PO4 2.4
g,MgSO4·7H2O 2.4 g,枸橼酸镁 0.6 g,甘油12 mL,蒸馏水600 mL,马铃薯淀粉30 g,新鲜鸡卵液1 000 mL,2%孔雀绿水溶液 20 mL。

1.4.3 制备方法
制备方法同酸性罗氏培养基，只是在培养基制成后分装于中型试管前，按每100 mL培养基加入1 mL利福平稀释药液，混匀，再行分装中型试管，加温凝固成斜面。

1.4.4 利福平药液配制及稀释
利福平药物为纯品，生物效价为1 000 μg/mg。

参照文献〔2〕，配制2个浓度的含药培养基，药物浓度为：50 μg/mL、250 μg/mL。

根据痰培养阳性标本例数，每支试管含培养基7 mL，计算所需培养基体积。

每100 mL培养基加入1 mL利福平稀释药液。

1.4.5 菌悬液的制备及接种方法
参照《全国临床检验操作规程 (第3版)》进行。

1.4.6 质控
每批药敏试验应以结核分枝杆菌参考菌株（H37Rv）检测含药培养基质量。

1.4.7 结果判定
对照培养基菌落数必须在200以上且无融合。

若菌落数低于50时，重新做药物敏感性测定。

（-）：培养基斜面上无分枝杆菌菌落生长。

（1+）：菌落数约占斜面面积的1/4。

（2+）：菌落数约占斜面面积的1/2。

（3+）：菌落数约占斜面面积的3/4。

（4+）：菌落呈菌苔样生长。

菌落数少于20个时，报告菌落数。

含药培养基菌落数少于20个时，当作不生长。

低浓度含药培养基上生长的菌落数多于20个时，即可判定为耐药。

低浓度生长、高浓度不生长为中度耐药；高、低浓度均生长为高度耐药。

2 结果
2.1 痰涂片情况 131例肺结核病人标本中，共有21例痰涂片为阳性,阳性率为16.0%。

2.2 痰培养情况 131例标本中，经培养有菌生长且经抗酸染色镜检后，共有56例确定为结核分枝杆菌，阳性检出率为42.7%。

两种检测方法其阳性检出率比较，差异有显著性（P0.05）。

培养法高于直接涂片法。

见表1。

表1 直接涂片法和培养法检出阳性结果（略）
Tab.1 The results of sputum fluid examination with direct smear and culture
与直接涂片法比较：* P0.05（χ2检验）
2.4 药敏试验结果
质控H37Rv生长情况：对照培养基为4+，高、低浓度含药培养基均不生长，为敏感。

故所配制的培养基质量合格，能用于药物敏感性测试。

56株痰培养阳性标本中，共有17株出现耐药，总耐药率为30.3%，其中，属中度耐药有10株，耐药率为17.8%，属高度耐药有7株，耐药率为12.5%。

见表2。

表2 56株痰培养阳性标本利福平敏感性测定结果（略）
Tab.2 The results of susceptibility testing against rifampicin in 56 positive samples
3 讨论
直接涂片检查法和分枝杆菌培养法是结核病实验室诊断中常用的2种方法，2种方法的阳性检出率对结核病实验室诊断有重要影响。

本研究中培养法
阳性检出率高于直接涂片检查法。

因此，临床上可将2种方法结合使用，以提
高结核菌的阳性检出率。

耐药性试验不仅是临床选择和评价化疗方案的依据，更是流行病学的重要指标。

我国于2000年开展了第4次全国结核病流行病学抽样调查，结果显示，利福平耐药的初始耐药率为10.3%〔3〕，本研究中利福平敏感性试验初始耐药率为30.3%，比全国流行病学调查测出的耐药率要高；与其他省份耐药情况相比，湖北省的研究显示结核杆菌对利福平的初始耐药率为3.8%〔4〕，福建省的为9.5%〔5〕，本研究中利福平初始耐药率高于该两省；与广东省内其他城市相比，深圳市利福平初始耐药率为7.7%〔6〕，东莞地区为7.5%〔7〕，本次药敏实验利福平初始耐药率也均高于两市的研究结果。

利福平自1971年发明以来，一直是结核化疗方案中的一个关键药物。

特别在短程化疗中起着重要作用。

而对利福平的耐药意味着一方面由于患者对利福平耐药，临床上须加大用药剂量或改用其他抗结核药物，使患者的疗程延长，增加患者的危险和经济负担；另一方面扩大耐药性传播的机会，使得总体人群暴露于耐药结核杆菌的危险性增加。

研究表明〔8〕，利福平产生耐药性是由于其作用靶分子RNA多聚酶亚单位的编码基因（rpoB）突变所致。

由于结核分枝杆菌产生自然耐药变异的频率很低，造成耐药的主要原因是治疗过程中不合理的联合用药、间断用药、不执行归口管理与治疗等。

因此，在今后的结核病防治工作中，重点为社会性综合防治措施，抓好结核病人的发现、登记、管理和合理治疗。

坚持在直接面视短程化疗(DOTS)〔9〕下,早期、适量、规律、全程、联合应用敏感药物或抗结核药物复合剂,辅以免疫剂治疗,使得在强化期内迅速、大量杀灭结核菌,使痰菌转阴。

对于耐药病例防治,须坚持联合用药的原则，根据既往用药史和药物敏感性试验制定个体化治疗方案。

结核病防治有关部门也应加强对耐药菌株的检测，掌握结核病耐药趋势，以指导临床合理、有效用药。

【参考文献】
〔1〕 DONALD A E,HANS L R,THURIDUR A,et al. Manage ment of tuberculosis,a guide f。