超声波对纤维素酶活性影响的研究进展

第29卷第1期2021年3月
纤维素科学与技术
Journal of Cellulose Science and Technology
V ol. 29 No. 1
Mar. 2021
文章编号：1004-8405(2021)01-0051-08 DOI: 10.16561/ki.xws.2021.01.02
超声波对纤维素酶活性影响的研究进展
胡芳1,2，董旭1,2，史长伟1,2，宋庆龙1，郑岩清1，于昊楠1
（1. 齐齐哈尔大学轻工与纺织学院，黑龙江齐齐哈尔161006；
2. 亚麻加工技术教育部工程研究中心，黑龙江齐齐哈尔161006）
摘要：木质纤维素酶解生成可发酵糖，是生物乙醇生产的关键步骤，超声波处理可提高纤维素酶的
活性，强化酶解，增加葡萄糖和乙醇的产率。

综述了超声波强化纤维素酶解的应用，超声波处理对纤
维素酶空间结构以及纤维素酶解动力学和热力学的影响。

分析了超声波对纤维素酶活性的负面影响，
并提出了进一步深入研究的方向。

关键词：纤维素酶；超声波；木质纤维素；酶活力
中图分类号：O629；TB559 文献标识码：A
木质纤维素生物质是地球上最丰富的可再生资源之一，主要来源于农、林业废弃物和部分城市固体废物，是第二代生物乙醇的生产原料。

木质纤维素生物质转化为生物乙醇，可减少废物处理费用，同时满足对能源日益增长的需求。

木质纤维素生物质生产生物乙醇主要包括三个步骤：1）预处理，将难降解的木质纤维素转化为反应性纤维素中间体；2）酶解纤维素，利用纤维素酶将反应中间体水解为可发酵糖（如葡萄糖）；3）发酵。

对于生态友好和经济有效地生产生物乙醇，木质纤维素转化为可发酵糖是关键步骤。

与酸水解等替代方法相比，酶解反应在较温和的条件下进行，产率较高，副反应较少，需要较少的能量[1]。

然而，传统的纤维素酶解是一个非常缓慢的过程，实现可观的转化率（60%～80%）通常需要大约70～120小时[2]。

开发强化预处理和酶解的有效手段仍然是生物燃料生产的主要瓶颈[3-4]。

纤维素酶是主要由真菌、细菌产生的一组酶，包括内切葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（CBH Ⅰ，EC 3.2.1.176；CBH Ⅱ，EC 3.2.1.91）和β-D-葡萄糖苷酶（或称纤维二糖酶）（EC 3.2.1.21），它们以相互作用的方式对纤维素进行水解[5]。

纤维素酶广泛应用于制浆造纸、纺织、生物乙醇、酿酒、食品加工业、饲料工业、农业等各个领域。

鉴于纤维素酶的商业重要性，寻找提高纤维素酶活性的有效方法是十分必要的。

近年来，大量的研究证实，超声波处理可强化物理、化学和生物过程，液体介质的超声波作用诱发了空化，在时间和空间尺度上产生强烈的能量集中，显著地改善了过程的动力学。

超声波处理可提高纤维素酶的活性，有利于减少纤维素酶解糖化的反应时间、降低酶用量、提高可发酵糖和乙醇的产量。

1 超声波产生以空化为主的多种效应
超声波在介质中传播时，产生压力波，该压力波在介质中形成高压区（压缩区）和低压区（稀薄区）。

收稿日期：2020-10-10
基金项目：黑龙江省省属本科高校基本科研业务费专项类项目（135409707）；齐齐哈尔大学大学生创新创业训练计划项目（202010232242）。

作者简介：胡芳（1970~），女，博士，教授；研究方向：生物质资源利用。

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52纤维素科学与技术第29卷
在高压和低压的区域，介质分子分别收缩和膨胀。

在膨胀过程中，分子被拉开，从而产生微小的空腔或微气泡，当达到临界半径时，由于内爆而释放出非常高的局部能量密度，这就是空化效应[6]。

在超声波空化泡崩溃的瞬间，在其周围产生局部高温、高压以及相伴随的强烈冲击波，同时产生高能中间体[7]。

因此，在超声波产生最基本的空化效应的同时，伴随着热效应、机械效应、热解和自由基效应等。

几微秒时间的空化产生局部高温和高压，而整个环境仍然相当于周围大气条件，因此空化可在环境条件下引发各种物理和化学变化。

机械效应表现为强烈的微射流、冲击波、剪切和振动，增强了介质中大分子、颗粒和悬浮细胞的运动，传质速率显著增加，这对于非均相系统中的化学反应，是非常重要的。

空化引起分子分裂而形成的自由基可以氧化有机物并协助其溶解[8-9]。

2 超声波强化纤维素酶解的应用
如表1所示，研究者们采用多种底物，研究了超声波处理对纤维素酶活性、纤维素酶解过程和产物产率的影响。

表1 超声波强化纤维素酶解的应用
底物超声波处理参数主要影响文献微晶纤维素180.8 W·cm-2、20 kHz酶活性提高[10]
CMC（羧甲基纤维素）
游离酶：15 W、24 kHz
固定化酶：60W、24 kHz
游离酶活力提高18.17%；
固定化酶活力提高24.67%
[11]
CMC17.33 W·cm-2、20 kHz 酶活力提高25%左右[12]
CMC和滤纸 6 W·cm-2、20 kHz 羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活
分别提高了14.4%和28.5%
[13]
滤纸220 W、40 kHz酶活力提高30%[14] 玉米秸秆80 W、20 kHz纤维素酶催化效率提高约70%[15] 旧报纸60 W、20 kHz、占空比70%还原糖的释放浓度达到对照样的2.4倍[1]微晶纤维素104 W、611 kHz葡萄糖产率提高1.56倍[2]
可溶性CMC和不溶性纤维
素11.8 W·cm-2、20 kHz、占空比10%
可溶性CMC水解速度是对照样的2倍、
不溶性纤维素水解速度也有所提高
[16]
棉织物43.4 W·cm-2、20 kHz还原糖产率提高54%[17]甘蔗渣0.46 W·cm-2、40 kHz水解效率提高1倍[18] 银胶菊35 W、35 kHz、占空比10%酶解动力学提高6倍[19] 甜根子草、薇甘菊、
马缨丹和凤眼莲
35 W、35 kHz、占空比为10%酶解动力学提高近10倍[20]
银胶菊35 W、35 kHz、占空比为10%加速酶解和发酵[21]花生壳、椰子壳和开心果壳80 W、20 kHz、占空比70%还原糖产量达到对照样的2倍左右[22]玉米芯60和120W、20 kHz、占空比50%葡聚糖消化率分别提高75.6和58.9%。

[23]甘蔗渣150.7 W·cm-2、20 kHz还原糖浓度达到对照样的约1.9倍[24]稻草300 W、40 kHz还原糖产率增加19.5%[25] 甘蔗渣132 W、40 kHz提高葡萄糖产量[26] 甘蔗渣240 W、24 kHz提高葡萄糖和乙醇产量[27]
木屑50 W、20 kHz、占空比70%1 h 超声波强化酶解，与常规搅拌3小时的还
原糖产率相当
[28]
棕榈叶200 W、37 kHz生物乙醇浓度和产率提高[29]
甘蔗渣60 W·cm-2、24 kHz 在直接和间接超声作用下，葡萄糖最高产率
分别为31.3 g·kg-1和60.6 g·kg-1
[30]
第1期胡芳等：超声波对纤维素酶活性影响的研究进展53
Silvel等[10]改变超声波处理参数，测定了羧甲基纤维素酶活，在最佳条件下（170 s，180.8 W/cm2，25℃），无底物时，羧甲基纤维素酶活比对照样高13%，在底物（微晶纤维素）存在下，羧甲基纤维素酶活比对照样提高33.87%，还原糖浓度8.83 g/L，水解率达到42.08%，生产效率提高21%，酶处理成本降低23%。

Wang等[11]探讨超声波对游离纤维素酶活性和以壳聚糖为载体的固定化纤维素酶活性的影响，研究发现，游离酶的分子结构发生了变化，在最佳超声波处理条件下，酶活力比对照样提高了18.17%；适当的超声波预处理增大了固定化酶的比表面积，使酶在水解过程中更容易攻击底物，在最佳超声波处理条件下，酶活性比对照样提高24.67%。

Lunelli等[18]研究了超声波辐照对甘蔗渣酶解的影响，超声波处理和无超声处理的甘蔗渣水解效率分别为35.0%和17.0%。

Singh等[19]以超声波促进银胶菊酶解，超声波辅助酶解14 h内还原糖总得率为711.3 mg/g，对照试验中酶解96 h的糖产量为593.4 mg/g，酶解动力学提高6倍，超声波使总还原糖产量增加约20%。

Borah等[20]还利用超声波促进杂草酶解，超声波代替机械搅拌可以使水解动力学提高近10倍，机械搅拌120小时与超声波处理10小时获得了相同的糖产量。

Subhedar 等[1]利用废报纸酶解生产可发酵糖，并与常规酶解进行了比较。

在相同的底物浓度下，常规酶解的条件为：酶用量0.14 %（w/V）、水解72 h，还原糖得率11.569 g/L；以超声波辅助酶解，酶用量0.08 %（w/V）、水解6.5 h，还原糖得率27.6 g/L。

超声波强化使酶解时间大大缩短，酶用量显著减少，还原糖的释放浓度增加。

Subhedar等[22]以花生壳、椰子壳和开心果壳三种木质纤维素生物质为原料，超声波辅助碱预处理后进行常规酶解和超声波辅助酶解，得到了相似的结果。

Silvello等[24]利用超声波对酶-底物进行预处理，然后在50℃、300 r/min条件下水解24 h。

超声波预处理的最佳条件为150.7 W/cm2、20 kHz、330 s和25℃，纤维素酶活性提高了42.35%，还原糖浓度达到对照样的1.9倍左右。

以上研究表明，适当的超声波处理可提高纤维素酶的活性，利用超声波处理可强化多种纤维素生物质的酶解，增大酶解速率、减少酶解反应时间、降低酶用量、提高可发酵糖以及生物乙醇产量。

3 超声波处理对纤维素酶空间结构的影响
酶的空间结构对催化效率、稳定性和选择性起着至关重要的作用。

超声波引起的周期性压力波动，可以改变酶的三维结构，从而影响其活性。

研究者们利用圆二色（Circular Dichroism，CD）光谱法和内源荧光光谱法研究了超声波对酶分子空间结构的影响。

Subhedar等[12]研究发现，与未处理酶相比，最佳条件下进行超声波处理后，α-螺旋含量下降了12.4%，无规螺旋增加了29.6%。

Wang等[6]发现，经18 kHz、5 W、5 min，24 kHz、15 W、10 min，26 kHz、20 W、10 min的超声波处理，纤维素酶的酶活力分别提高到52.41 μ/mL、59.58 μ/mL和54.77 μ/mL。

但是，在29 kHz、50 W、30 min条件下，纤维素酶α-螺旋含量增加且无规卷曲含量减少，纤维素酶的酶活力下降到31.62 μ/mL，说明酶活性中心可能覆盖了更紧密的结构，从而阻碍了底物与酶发生反应。

Fan等[31]研究了超声波处理对β-D-葡萄糖苷酶的影响，差示扫描量热法和热重分析的结果与圆二色谱一致，超声波导致其二级结构的组成发生显著变化，无序结构(无规卷曲)增加而有序结构（α-螺旋）减少。

有研究者发现，超声波对蛋白质构象的影响同样适用于固定化酶[10, 32]，Ladole等[32]将纤维素酶固定在磁性纳米粒子上，并于最佳超声波条件（即24 kHz、6 W、6 min）下处理。

结果表明，酶催化活性提高近3.6倍。

对超声波处理前后该固定化纤维素酶的二级结构比率进行了计算，发现超声波处理使β-片层和无规卷曲分别增加了6.23%和0.69%，而α-螺旋和β-转角的含量则减少了1.8%和2.11%。

以上利用CD光谱法得到的二级结构比率表明，适当的超声波处理使纤维素酶的α-螺旋含量下降而无规卷曲增加，使纤维素酶表现出更高的柔韧性，有助于提高
54纤维素科学与技术第29卷
其活性，并因此提高催化效率。

蛋白质的荧光行为主要归因于芳香族氨基酸残基，尤其是色氨酸残基。

经超声波处理的纤维素酶荧光强度降低，最佳荧光发射波长没有发生变化[5, 33]。

这证实，超声波处理诱导蛋白质分子去折叠，破坏了蛋白质分子间的疏水相互作用，使分子内更多的疏水基团和区域暴露在外。

Nguyen等[13]对纤维素酶溶液的蛋白质组分进行了研究，电泳分析表明，纤维素酶制剂在超声波处理前和超声波处理80秒后的蛋白质成分完全相似，这一结果证明，超声波并没有引起纤维素酶分子的剧烈损伤，其一级结构没有发生改变。

Sun等[34]关于超声波对β-D-葡萄糖苷酶影响的研究得出了相同的结论。

一般来说，酶是单体球状蛋白，其催化活性取决于其活性中心的空间结构。

总的来说，适当的超声波处理，可以在不改变酶的结构完整性的情况下使蛋白质分子发生有利的构象变化，使酶的活性部位暴露得更加充分。

4 超声波对纤维素酶解动力学和热力学的影响
4.1超声波处理对纤维素酶解动力学的影响
Subheder等[12]、Sulaiman等[16]、Nadar等[35]由Michaelis-Menten方程变换，绘制了Lineweaver-Burk曲线，得到当酶被底物饱和时的最大反应速率（v max）和Michaelis常数（K m）。

结果表明，与未处理酶相比，超声波处理后纤维素酶v max增加，而K m降低。

Silvell等[10]得到了相似的结果，在超声波处理下，K m比对照组降低23%，v max提高了21%。

v max反映了底物饱和时酶反应的极限速率，而K m则表示酶与底物之间的亲和力。

v max的增加表明，在超声波场下，反应物向酶活性部位大量转移，酶-底物复合物快速裂解，以及可溶性产物快速扩散[20, 36]。

另一方面，超声波处理下K m的降低，是由于更快的传质和酶与底物相互作用增强，这归因于在反应混合物中由空化产生的强烈机械搅拌效应[33, 36]。

Singh等[19]和Borah 等[20]采用Holtzaple等人提出的一级产物抑制模型（又称HCH-1酶解纤维素模型），研究了超声波对银胶菊和四种杂草的酶解强化过程，该模型考虑了酶在纤维素上的吸附、酶与纤维素的复合以及复合物转化为可溶性产物。

此外，还考虑了产物对三种酶形式（游离、吸附和复合）的抑制作用。

根据模型参数拟合结果，提出超声波对酶解系统的影响在于：1）反应速度增加；2）酶-底物亲和力增加；3）产物抑制减少；4）酶蛋白二级结构的变化导致酶活性提高。

超声波使酶解动力学强化的主要原因是[20]：1）酶二级结构的构象变化，即α-螺旋含量减少，同时β-片层和无规卷曲含量增加，这些构象变化导致酶蛋白展开，活性位点产生/暴露；2）在介质中产生强烈的微对流，增强酶-底物的亲和力，减少酶的产物抑制，同时提高酶/底物复合物的裂解速度。

4.2超声波处理对纤维素酶解热力学的影响
Subhedar等[12]根据实验数据，对活化能（E a）、焓（∆H）、熵（∆S）和自由能（∆G）等热力学参数进行了分析。

未处理的纤维素酶和超声处理后纤维素酶的活化能分别为53.3 kJ/mol和18.8 kJ/mol，表明超声波显著降低了反应所需的能量屏障。

E a值降低是由于酶分子发生有利的构象变化，暴露活性位点。

超声波处理后∆G值下降1.3%，说明纤维素酶活性提高。

超声波处理后∆H降低了68%，这可能是由于超声波诱导氢键断裂以及内部疏水核的分散。

∆S代表过渡态和基态之间局部无序程度的变化。

∆S减少了37.3%，可归因于氨基酸残基的氧化修饰和交联聚合，导致酶活性的提高。

此外，超声波处理的化学效应、由气泡振荡或内爆引起的微湍流和声波导致静压和流体动应力的升高，引起次级键（如氢键、静电键和范德华键）的断裂。

Nadar等[35]也报道了超声波处理对酶解热力学参数∆H、∆S和∆G的类似影响。

第1期胡芳等：超声波对纤维素酶活性影响的研究进展55 5 超声波对纤维素酶活性的负面影响
超声波处理对酶活性也存在负面影响，总的来说，超声波空化产生高活性中间体，如H‧、OH‧、H2O2、HO2和H2，可能与底物结合域或催化域的氨基酸残基发生反应[13]。

有研究者提出[37]，活性中间体与蛋白质骨架作用，会导致酶的聚集，从而阻碍活性位点，同时也降低蛋白质的稳定性。

此外，超声波处理产生的剪切力在酶失活中也有相当大的作用[13, 38]。

超声波参数的设置对酶活性有重要影响，低强度超声波将酶分子聚集体分解成更小的碎片，暴露更多的活性位点，有助于酶活性的增加；同时，高强度超声波结合长时间处理导致自由基反应，可使酶失活[39-40]。

Wang等[11]发现，当超声功率增加到15 W时，纤维素酶活性增强，进一步增大超声功率并没有提高纤维素酶的活性，在35 W和40 W时酶催化活性降低。

Su等[23]的研究发现，在高强度（＞120 W）下，纤维素酶活性在50℃时明显下降。

然而，在所有输出功率（0～500 W）下，37℃时的纤维素酶活性都是稳定的。

Szabó等[39]发现，在40%振幅（40 kHz，最大功率500 W）下，酶活性在65 min内损失了12%。

当振幅增加到60%和80%时，酶活性下降更为显著，65 min后酶的活性分别只有原来的80%和75%。

Silva[41]等发现，在20kHz和50W/cm2的超声波条件下，β-D-葡萄糖苷酶活性提高1.5倍。

Chen等[42]发现，在968 W/cm2和10 min时，β-D-葡萄糖苷酶活性下降了84.71%。

Sun等发现[34]低温度（20～45℃）、低超声强度（＜181.53 W/cm2）和短处理时间（＜15 min）导致了β-D-葡萄糖苷酶的激活，而高温度（45～60℃）、高超声强度（＞181.53 W/cm2）和长处理时间（＞15 min）导致其抑制。

不同的文献中，引起酶活性下降的超声波参数是不同的，这与超声波发生器的类型、底物的性质、其他参数的设定等有关。

6 结语与展望
适当的超声波处理可加快纤维素酶解、提高可发酵糖以及生物乙醇产量，但在这一领域的大多数报道都是评价超声波强化过程的有效性，而对超声波促进纤维素酶催化活性的关注较少。

有必要在这一领域进行更多的研究，以更好地理解超声波处理与酶促反应之间的关系，这将有助于在超声波生物技术领域开发有效的工艺。

对于超声波提高纤维素酶活性的深入研究，建议从以下几个方面开展。

1）超声波空化的物理/化学与酶解的生物化学之间的确切联系尚未建立
有必要研究在不同实验条件下的超声波效应，建立数学模型，量化可变参数对超声波整体效应的贡献，从而预测过程效率的变化。

了解酶结构变化与超声波辐照的关系，了解酶反应表观动力学与酶活性位点的数量和分布之间的联系。

2）超声波处理提高酶活性，在许多领域有着应用，有不同的研究结论和有趣的收获，超声波强化木质纤维素酶解可由其他领域的研究成果获得启发，但超声波对不同的酶的影响是不同的，必须重视具体底物和纤维素酶系统的特殊性。

3）超声波与酶解助剂协同作用的研究
添加酶解助剂可提高纤维素酶活性，如在酶解体系中加入适量的水溶性木质素、非离子表面活性剂，可有效减少底物木质素对纤维素酶的无效吸附[43-44]；添加纤维二糖脱氢酶、扩展蛋白和膨胀素，可显著提高纤维素糖化效率[44]；Mg2+、Co2+、Ca2+和阿魏酸、对香豆酸等对纤维素酶具有激活作用[45]。

超声波强化与以上酶解助剂协同作用的研究将为提高纤维素酶酶解效率提供更多的机遇。

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Research Progress on the Effect of
Ultrasound on Cellulase Activity
HU Fang1,2, DONG Xu1,2, SHI Chang-wei1,2,
SONG Qing-long1, ZHENG Ying-qing1, YU Hao-nan1
（1. College of Light Industry & Textile Engineering, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China;
2. Engineering Research Center of Flax Processing Technology Education Ministry, Qiqihar 161006, China）
Abstract: I n bioethanol production, e nzymatic hydrolysis of lignocellulose into fermentable sugars is a key step. Ultrasonic treatment can improve cellulase activity, strengthen enzymatic hydrolysis and increase the yield of glucose and ethanol. This paper reviews the applications of ultrasound intensification on enzymatic hydrolysis of cellulose, the effect of ultrasonic treatment on the spatial structure of cellulase, and on the kinetics and thermodynamics of enzymatic hydrolysis of cellulose. The negative effect of ultrasound on cellulase activity are analyzed, and the further research direction were prospected.
Key words: cellulase; ultrasound; lignocellulose; enzymatic activity。