病毒学-病毒检验

病毒的分离和鉴定（含义）：指从病人、带毒者、外界
环境中采集标本经过适当的处理,采用一系列物理、化学、 生物学等手段,将病毒从标本中分离出来,并通过有关特 异性方法鉴定属于何种病毒,这一方法称为病毒的分 离与鉴定。
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病毒的分离与鉴定包括： 1、病毒材料的采集与准备 →2、病毒的
分离与培养→3、病毒的形态学观察→4、 病毒的理化特性测定→5、病毒的血清 学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本 过程。
实验现象：如果对照组血吸附阳性,而实验组阴性,说明先前接种
的标本中存在能干扰仙台病毒增殖的病毒,此结果即为干扰试验 阳性。
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（3）病毒的理化特性测定
包括病毒核酸类型鉴定、耐酸性试验、脂溶剂敏感性
试验、耐热性试验、胰蛋白酶敏感性试验等
通常以细胞培养或鸡胚培养为观察体系,应设立已知病 毒为对照。
标本处理：
采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前,都需要做适当的处 理,以保证病毒分离的成功几率。
采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴结等, 可取一小块进行充分研磨,加入含青、链霉素的Hanks液,离心取上
清液作为接种物;
鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便,应加入高浓 度的抗生素,充分混匀后,置4℃冰箱内处理2~4h或过夜,离心后
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(2)病毒的生物学特性
①细胞病变效应
哪三种现象？
病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。
➢ 不同的病毒具有不同的敏感细胞，而又能引起不同的细胞病变 效应。
➢ 例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上,出现细胞融合,产生
多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒、肾综合征出
血热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到WI-38或人胚肺细 胞培养上出现散在的、局部堆积的巨大细胞，则要考虑巨 细胞病毒的可能性；肠道病毒能使细胞圆缩、变小、分散， 往往全部细胞受到破坏；腺病毒能使细胞肿大，颗粒增多， 细胞聚集成葡萄状。
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（一）标本的采取与送检
病料采集适当与否,直接影响病毒的检测结果。 一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌物或粪
便等,主要因动物及病毒的种类而异, 例如检测犬细小病毒或轮状病毒,一般应采腹泻幼犬或犊
牛的粪便;
怀疑为口蹄疫的猪或牛,则应采其水疱液及水疱皮送检。
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病毒学-病毒检验
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常用的病毒检验方法包括：
一、病毒的分离鉴定 二、病毒感染性的检测 三、病毒颗粒检测 四、病毒的血清学检查 五、病毒的分子(蛋白和核酸)检测
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一、病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定可为病毒感染提供最为直接的病 原学证据，同时可为进一步的病毒学研究提供材 料。
常见病毒常用实验动物及接种途径
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实验动物采血
在动物实验的期间或结束时采集动物血液检测病毒或特异性抗体。
实验动物采血分为致死性采血和非致死性采血两种。
致死性采血是指尽量采集动物血,直至动物死亡。
非致死性采血是指采集一定量的动物血而不致动物死亡。
对采血动物,应在禁食24h后采血。采血应无菌操作。 不同动物采用不同的采血方法。常用的有心脏采血法、眼眶采血
是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类不同，选择敏感 动物及适宜接种部位，如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接 种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。
动物的接种途径要根据病毒种类、实验动物种类、接
种材料等选择合适的接种途径。动物接种途径的选择 正确与否对提高病毒分离成功率也起到重要作用。
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②血吸附和血凝作用
有些病毒感染细胞后,细胞膜上可镶嵌着病毒基因 编码产生的糖蛋白,其中有些能吸附特定种类的红细 胞,或将细胞培养单层刮下后,经过适当处理,可以凝集特 定种类的红细胞,此类糖蛋白在细胞表面形成刺突,称 为血凝素。
如流感病毒、副黏病毒、风疹病毒等感染细胞后可产
取上清做接种用;
咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有2%小牛血清和一定 浓度的青、链霉素的Hanks液中,充分刷洗棉拭子,反复冻融 3~5次,离心后取上清液作为接种材料。
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（二）病毒的分离与培养
细胞培养、鸡胚和实验动物可用于病毒的分离与培养,其中
细胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。
• 绿豆芽酶可降解单股核酸,用它可进一步鉴定核酸是 单股或双股。
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可直接用纯化的病毒核酸通过电镜观察，对其进行 鉴定。但技术要求较高。
近年来,PCR核酸测序技术的应用使得病毒核酸型鉴
定的可行性大为增加。 （观看PCR视频）
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②脂溶性试验
用乙醚或氯仿处理待检病毒液,而后与未处理者比较 其TCID50的变化,以判断是否敏感。
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应注意下列原则：
1.对本身带有杂菌 (如咽喉拭子、粪便) 或易受污染 的标本，要进行病毒分离培养时，应使用抗生素。
2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低温保存
并尽快送检。
3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和病后2～ 3w内各取1份血清，以便对比双份血清抗体效价的动态
变化。
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用于病毒分离与培养的细胞有原代细胞、二倍体细胞株和传代细
胞系,一般说来,本动物的原代细胞最为敏感,但不如传代细胞方便
易得.
例如猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原代或二倍体细
胞,但该细胞生长缓慢,通常用PD5(猪甲状腺细胞系)取代。
培养方法常用的有静置培养和旋转培养,有的病毒如轮状病毒,
（3）电子显微镜技术
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（1）病毒的血清学鉴定
病毒分离后,可用已知的抗病毒血清或单克隆抗体,对分 离毒株进行血清学鉴定,以确定病毒的种类、血清型
及其亚型。
常用的血清学试验有血清中和试验、血清抑制试验、 免疫荧光试验等。
此外,可采用一些血清学技术如免疫沉淀技术和免疫转印
技术分析病毒的结构蛋白成分。
病毒的理化特性是病毒鉴定的重要依据
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①代谢抑制法鉴定病毒核酸类型
病毒核酸类型鉴定是病毒理化特性测定的最主要 指标。
• 添加氟脱氧尿核苷(FUDR)或类似物于病毒培养物中, 病毒复制被抑制者,即为DNA病毒,否则为RNA病毒,也 可用DNA酶或RNA酶分别作用,以判定核酸的性质。
在病毒的初步鉴定方面也是非常重要的。如乙脑小鼠脑内接种潜
伏期一般为4d,狂犬病脑内接种潜伏期一般为6~8d。
②接种动物的饮食情况是否有变化,活动与饮食能力是否发生改变, 粪便是否有变化。
③每天在同一时间测量动物的体重和体温,比较接种前后变化 情况。
④观察局部或全身性反应,如出现毛松、软弱无力、震颤、不安、
生血吸附现象,或通过血凝实验来证实病毒的存在。
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例子
新城疫病毒能吸附和凝集豚鼠红细胞 风疹病毒能吸附和凝集鸽子、绵羊等红细胞 病毒的血凝作用往往需要一定的pH和温度,利用
血吸附和血凝集现象可以为初步判定属于何种病毒提 供重要思路。
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③干扰现象
一种病毒感染细胞后,可以干扰另一种病毒在该细胞内的增殖,
抗力,属肠道病毒。
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2、接种动物的观察
根据动物的感染范围,可初步推断属于何种病毒。 接种动物的观察是非常重要的,通过观察试验动物的反应
有时也可初步鉴定何种病毒。
每天都需要观察,有时1d需要观察数次。
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观察指标:
①动物发病的潜伏期,病毒感染都有一定的潜伏期。因此,潜伏期
抽搐,甚至死亡等全身症状,可考虑神经系统感染的可能性。
对照组不接种病毒,用生理盐水代替,其他步骤和观察指标与试验组 完全相同。
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3、最终鉴定
病毒的最终鉴定需要免疫学方法、分子生物学方法、 电子显微镜与免疫电子显微技术等特异性方法加以 鉴定。
（1）病毒的血清学鉴定
（2）病毒的分子生物学鉴定
这种现象称为干扰现象。
利用干扰现象可以检查出一些不引起细胞病变、血凝、血吸附的病 毒。
如：鼻病毒就可以利用干扰现象进行初步鉴定。
实验组：感染人胚肾细胞管或培养板细胞用人或豚鼠红细胞做
血吸附实验,如果阴性,用Hanks液洗涤3次,然后接种仙台病 毒,33℃ 培养48h,做血吸附实验。
对照组：正常细胞只接种仙台病毒。
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（三）病毒的鉴定
步骤： 1、初步鉴定 2、接种动物的观察 3、最终鉴定
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1、初步鉴定
(1)根据临床表现、流行病学特征与标本来源。初步
判定属于哪一类病毒 脑炎患者→脑脊液→ 乙型脑炎病毒 秋季腹泻病人→粪便→轮状病毒
发烧小孩（下肢麻痹）→粪便→脊髓灰质炎病毒
将两组的病毒液同时测定病毒滴度,如果试验组病毒滴度明显 降低,与对照组有明显差异,说明病毒对乙醚敏感,属于有膜病毒。 如果两组的病毒滴度没有显著差异,说明病毒对乙醚有抵抗力,属于
无膜病毒。
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③耐酸性试验
耐酸性试验和脂溶剂敏感性试验是最常做的两项理化指 标。
耐酸性试验设置缓冲液pH为3和7的病毒做比较。 通过肠道传播的病毒对酸有抵抗力,借此可鉴别某些
乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠等脂溶剂能破坏病毒的脂质 包膜。
有包膜的病毒对脂溶剂敏感,受脂溶剂的处理能使病 毒失去感染性;无包膜的病毒往往对脂溶剂有抵抗 力。因此,用乙醚等可以鉴定所分离的病毒是否有包 膜。
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病毒粒的结构模式图
包膜子粒
包膜
包膜病毒
壳粒
衣壳
核衣壳
核心（核样物）
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初次分离时旋转培养的成功率较静置培养高。
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1、病毒的分离
不同的病毒分离时采用不同的分离方法,这主要取决于 目的病毒的生物学特性。
主要有细胞培养法、鸡胚接种法、动物接种法等,而
对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动物模型的病毒,可采用
基因克隆的方法。
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（1）动物接种法
来自百度文库法、颈静脉采血法、颈动脉采血法、耳静脉采血法等。根据实验动
物和实验条件灵活选用。
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（2）鸡胚培养法
鸡胚对多种病毒敏感。
不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异很大,因此选 择适当的接种途径是病毒分离成功的关键。
一般采用孵化9～14天的鸡胚，根据病毒种类不同，将
病毒标本 接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部
病毒。
如肠道病毒与鼻病毒同为RNA病毒,肠道病毒对酸有抵
抗力,而鼻病毒则没有。
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处理方法:
试验组：病毒悬液用0.1mol/L的HCl调pH至3.0,37℃放置 2h后,用5.6%的NaHCO3调pH至7.2
对照组：除了不加酸外,其他步骤和试验组相同。
将两组同时测定病毒滴度,如果试验组病毒滴度明显降低, 与对照组有显著差异,说明病毒对酸敏感,不属于肠道病毒。 如果两组的病毒滴度没有显著差异,说明病毒对酸有抵
位有：尿囊腔、绒毛尿囊膜、卵黄囊和羊膜腔等。
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（3）细胞培养 (cell culture)法或组织培 养法 (tissue culture)
是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的 技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方 法。
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一般选择生长旺盛的敏感细胞用于病毒分离。 少数病毒例外,例如犬、猪等的细小病毒,病毒的复制
有赖于分裂旺盛的细胞,因此需将病毒接种与细胞 培养同步进行。
细胞培养技术在病毒发现、病毒研究、疫苗研制、抗 病毒药物筛选等病毒学发展的历程中发挥着重要作用。
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常见人类病毒的敏感细胞
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（4）分子生物学技术
对体外培养的细胞、鸡胚、动物不敏感的病毒,可采 用现代分子生物学技术,如基因克隆技术,对病毒的全 基因进行克隆,构建表达载体,并能表达出病毒样颗粒。
处理方法:
将病毒悬液2000~3000r/min离心20min,取上清液,分成两组： 一组为试验组：按与乙醚4:1的比例振荡混合均匀,管口密封
好,4℃过夜后,2000~3000r/min离心20min。此时液体分为两层,上层
为乙醚,下层为病毒液。吸取下层部分,避免混有乙醚。
另一组为对照组：不加乙醚,处理方法同试验组。