第三节农药残留分析

第三节农药残留分析
农药残留分析是比较复杂的分析技术，其中一项重要研究工作是建立合适的分析方法，以适应不同农药目标物、不同基质以及高选择性、高灵敏度的要求。

一、农药残留分析的特点
农药残留分析，主要是对农产品、食品和环境样品等待测样品中农药残留进行定性和定量分析。

包含已知农药残留的分析和未知农药残留分析两方面的内容。

农药残留分析技术自20世纪70年代至21世纪初期，有很大的变化和进展，表1-9列出了从样品量、提取、净化、测定和计算等方面的比较，并列出了目前广泛应用的QuEChERS 方法。

农药残留分析是较复杂的技术，其主要特点如下：
①样品中农药的含量很少。

每千克样品中仅有毫克（mg/kg）、微克（µg/kg）、纳克（ng/kg）量级的农药，在大气和地表水中农药含量更少，每千克仅有皮克（pg/kg）、飞克（fg/kg）量级。

而样品中的干扰物质脂肪、糖、淀粉、蛋白质、各种色素和无机盐等含量都远远大于农药，决定了农药残留分析方法灵敏度要求很高，对提取、净化等处理要求也很高。

②农药品种繁多。

目前在我国经常使用的农药品种多达数百个，各类农药的性质差异很大，有些还需要检测有毒理学意义的降解物、代谢物或者杂质，残留分析方法要根据各类农药目标物特点而定。

③样品种类多，有各种农畜产品、土壤、大气、水样等，各类样品中所含水量、脂肪量和糖量均不相同，成分各异，各类农药的处理方法差异很大。

④基于以上原因测定样品时对方法的准确度和精密度要求不高，而灵敏度要高、特异性要好，要求能检出样品中的特定微量农药。

二、农药残留分析的分类
（一）农药单残留分析
农药单残留分析（single residue method, SRM）是定量测定样品中一种农药（包括具有毒理学意义的杂质或降解产物），这类方法在农药登记注册的残留试验、制定MRL或在其他特定目的的农药管理和研究中经常应用。

对于某些特殊性质的农药，如不稳定、易挥发，或是两性离子，或几乎不溶于任何溶剂，甚至有些检测目标物结构尚不明确，对于这些农药，只能进行单残留分析，这种测定比较费时，花费较大。

（二）农药多残留分析
农药多残留分析（multi-residue method, MRM），是指在一次分析中能够对待测样品中多种农药残留同时进行提取、净化、定性和定量分析。

根据分析农药残留的种类不同，还可分为两种，一种多残留分析方法仅适用于同一类的多种农药残留，称为单类型农药多残留分析，也称为选择性多残留方法（selective MRM），同类型农药的理化性质相似，可以实现同时分析，如有机磷农药多残留分析、有机氯农药多残留分析、氨基甲酸酯农药多残留分析、磺酰脲除草剂多残留分析等；另一种是一种方法适用于多类型农药残留，也称多类多残留方法（multi-class multi-residue method）。

多残留方法经常用于管理和研究机构对未知用药历史的样品进行农药残留的分析，以及对农产品、食品或环境介质的质量进行监督、评价和判断。

三、农药残留分析的步骤
农药残留分析的过程可以分为：采样（sampling），样品预处理（sample pretreatment），提取（extraction），净化（clean-up），浓缩（concentration），定性、定量分析（analysis），确证（validation），数据报告（report），质量控制与质量保证（QA，QC）。

在这些过程中，还涉及到样品的传递、保存等操作。

样品预处理是指实际样品转变为实验室分析样品的过程，首先去除分析时不需要的部
分，如果蒂、叶子、黏附的泥土、土壤中的植物体、石块等，即样品制备（sample preparation）。

然后进行均质化过程，采用匀浆、捣碎等方法，得到具有代表性的、可用于实验室分析的试样，即样品加工（sample processing）。

提取过程通常是采用振荡、超声波、固相萃取等方法从试样中分离残留农药的过程，一般是转移到提取液中，此时，很多共提物也随农药一起存在于提取液中。

净化是采一定的方法，如液液分配、柱层析净化、凝胶渗透色谱（GPC）、吹扫蒸馏、固相萃取等去除共提物中部分色素、糖类、蛋白质、油脂以及干扰测定的其他物质的过程。

在有些农药残留分析中，为了增强残留农药的可提取性或提高分辨率、测定的灵敏度，对样品中的农药进行化学衍生化处理，称之为衍生化（derivatization）。

衍生化反应改变了化合物性质，为净化方法的优化提供了更多选择。

浓缩过程在农药残留分析中也是一个比较重要的环节。

由于农药残留多是微量或痕量水平，通过浓缩，可以提高检测响应值。

常用的浓缩装置有K-D浓缩器、旋转蒸发仪、氮气流浓缩器等。

有时也将样品的提取、净化、浓缩等环节统称样品前处理。

样品制备过程包括了样品预处理和样品前处理操作。

农药残留分析中常用的定性、定量分析方法有：气相色谱法，配备多种检测器，如FID、TCD、FPD、NPD、ECD、MSD等；液相色谱法，配备UVD、DAD、FD、MSD等检测器；薄层色谱法；酶抑制法；酶联免疫法等，还有一些其他方法，如毛细管电泳法等新技术。

人们通常把从分析仪器获得的与样品中的农药残留量成比例的信号响应称为检出（detection），把通过参照比较农药标准品的量测算出试样中农药残留的量称为测定（determination）。

数据报告不但是残留分析结果的计算、统计和分析，更是对残留分析方法的准确性、可靠性进行描述和报告，包括方法再现性、重复性、检测限、定量限、回收率、线性范围和检测范围等，更进一步则是方法的不确定度分析，以说明残留分析过程中的质量保证和质量控制。

本书将对样品制备、样品加工、提取、净化、浓缩、定量和定性分析等环节进行专门阐述。

第二节农药残留分析方法的确认
农药残留分析方法确认（method validation）是指为了证实一个分析方法能被其他测试者按照预定的步骤进行，而且使用该方法测得的结果能达到要求的准确度和精密度而采取的措施。

一般通过实施方法中所叙述的部分或整个步骤来达到这种确认。

国际标准化组织（ISO）对“方法确认”的定义是“通过检验和提供客观的证据可以证实，作为指定用途的分析方法，能够达到其特色的要求”（fit for purpose）。

对一个分析方法的确认，应该包括建立方法的性能特征、测定对方法的影响因素及证明该方法与其要求目的任务是否一致，即经过确认的方法能可靠地使用。

国际上通常是使用不同实验室间协作研究的结果对分析方法进行确认的。

但近期一些权威机构认为单个实验室可以根据规定的要求在实验室内部对农药残留分析方法进行确认。

对不同基质的样品，前处理步骤是不一样的，因此研究农药残留分析方法进行确认。

对不同基质的样品，前处理步骤是不一样的，因此研究农药残留分析方法时，必须开发该农药在不同样品基质中的残留分析方法。

确认农药残留分析方法必须提供方法的专一性、线性范围、回收率、精密度、检出限和定量限等方法参数的确认结果。

一、方法的专一性
方法的专一性，也称特异性（specificity），是指分析方法在样品基质中有其他杂质成分时，能准确地和特定地测出该农药的母体化合物、有关代谢物及杂质的性能。

特异性考察也
用于说明干扰物质对方法的影响程度，通常可通过峰纯度检验、空白基质、质谱、高分辨质谱和多级质谱等手段进行确证。

二、线性范围
线性范围（linear range）是通过校准曲线（calibration curve）考察，是表达被分析物质不同浓度与测定仪器响应值之间的线性定量关系的范围。

使用农药标样溶液，通常测定五个梯度浓度，每个浓度平行测定两次以上，采用最小二乘法处理数据，得出线性方程和相关系数（correlation coefficient）等，一般要求相关系数在0.99以上。

三、回收率
回收率（recovery）是指测定结果与分析样品中真值的符合程度。

在农药残留分析中常用添加回收率（fortified recovery）表示方法的准确率。

即空白样品中加入一定浓度的某一农药后其样品中此农药测定值对加入值的百分率。

用添加法测定回收率，原则上添加浓度应以接近待测样品的农药含量为宜。

但由于待测样品中的农药残留量是未知的，因此，一般以该样品的最高残留限量（MRL）和方法定量限（LOQ）作为必选的浓度，即回收率试验必须选至少2个添加浓度。

若没有MRL值参照时，以LOQ和高于LOQ10倍的浓度做添加回收率，每一个浓度进行5次以上的重复试验。

添加回收率结果应以接近100%为最佳，但由于杂质干扰，操作误差等诸多因素的影响，实际结果会有很大偏差。

不同添加浓度要求回收率见表2-1。

通常要求回收率应在70%~110%范围。

近期由于前处理方法的不断改进和高灵敏度、高选择性检测器的出现，分析工作者已可测定样品中越来越低的农药残留量。

但通常开发新的残留分析方法尤其是设计回收率试验时必须考虑该农药的MRL。

FAO于1990年在残留田间试验准则（guidelines on producing. pesticide residues data from supervised trials）中根据农药的最高残留限量提出相应较低的实测量也称报告限（lower practical analytical levels, LPL），实际上可以作为测定回收率时的最低添加水平。

有些农药的MRL值较高，回收率测定的报告限可根据表2-2进行设定。

如果有些农药的MRL标准定得很低，而在一定条件下分析方法的LOQ却不可能再下降，则LPL也可以定在MRL水平。

四、精密度
精密度（precision）是偶然误差的量度，即在一定条件下使用该方法对一均匀样品多次采样测定结果的分散程度。

与样品的真值无关；精密度在很大程度上与测定条件有关，通常以重复性（repeatability）和重现性（reproducibility）表示，两者进行的条件是不相同的。

重复性指由同一操作者采用相同方法，在同一实验室，使用同一设备，在短时间间隔的独立试验中对同一样品测定结果的一致性，称为实验室内标准差。

残留试验的相同样品必须从空白对照试验田采样来制备。

重现性指由不同操作者，采用相同方法，在不同实验室，使用不同设备，在不同时间的独立试验中对同一样品测定结果的一致性，称为实验室间标准差。

重复性或重现性的表征参数可以用标准偏差或相对标准偏差表示。

在残留分析中，一般采用相对标准偏差表示。

相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）是标准偏差在平均测定值中所占的百分率，也叫变异系数。

在进行添加回收率实验时，对同一浓度的回收率试验必须进行至少5次重复。

平行实验结果偏差与添加浓度相关，添加浓度愈低，允许偏差愈大，不同添加浓度回收率实验所要求的相对标准偏差见表2-3。

而在制剂分析中，由于分析物含量较高，对添加回收率以及相应的RSD要求就比农药残留分析高了很多，见表2-4。

五、检出限和定量限
（一）表达形式
在农药残留分析方法开发中，检出限（LOD）和定量限（LOQ）是非常重要的两个指标。

二者都是用于评价分析方法能够检测出的分析对象的最小含量或浓度。

是反映分析方法有效性的重要指标之一。

检出限（limit of detection, LOD），是指在与样品测定完全相同的条件下，某种分析方法能够检出的分析对象的最小浓度。

它强调的检出，而不是准确定量。

有时也称最小检出浓度、最低检出浓度、最小检出量、定性限等，单位以mg/kg或mg/L或ng表示。

定量限（limit of quantification, LOQ），是指在与样品测定完全相同的条件下，某种分析方法能够检测的分析对象的最小浓度。

它强调的是检出并定量。

有时也称测定限、检测极限、最低检测浓度、最小检测浓度，单位以mg/kg或mg/L表示。

用同一分析方法测定不同样品基质中的农药时，可得出不同的LOQ。

当分析方法的LOQ明显低于MRL，可对样品中MRL 水平的待测物进行准确测定。

因此一般要求LOQ最高不超过1/3MRL，如有可能，LOQ=1/5或更低。

如某农药的MRL=0.05mg/kg，则LOQ最好低于0.01mg/kg。

但对方法灵敏度较差的情况，至少应满足LOQ=MRL。

《农药残留试验准则》（NY/T788—2004）给出的LOD和LOQ的定义如下。

最小出量（limit of detection），指使检测系统产生3倍噪音信号所需待测物质的质量（以ng为单位表示）。

最低检测浓度（limit of quantification），指用添加方法能检测出待测物在样品中的最低或者LOQ水平。

背景值产生的原因主要有三个方面。

①试剂、玻璃容器背景这可以通过采用更高级别的溶剂、重蒸，以及充分洗涤玻璃容器（洗涤液、蒸馏水、丙酮、高温烘干）使之降低。

②基质噪音可以采用更有效的净化方法、使用选择性检测器来降低。

③仪器背景每台仪器都有一定的信噪比（signal-to-noise，S/N），可以通过仪器调协降低其水平，采用恒流电源、恒温操作环境也有助于降低信噪比。

在农药残留分析中，方法的LOD或LOQ应根据分析要求而定，对于最大残留限量（MRL）高的农药，不必追求过低的LOD或LOQ，但亦不应高于MRL，一般比MRL低一个数量级。

此值因分析方法而异，单位为mg/kg或mg/L，以一位有效数字表示。

对检测不出的残留量，不应用“残留量零”或“无残留”记载，而应写为“＜检出限”或“ND （non-detect-able, no detectable residues）”、“未检出”字样；高于LOD但低于LOQ水平的残留量，可以用“痕量”表示或“＜LOQ”。

但均应同时注明方法的LOD或LOQ具体数值。

第四章样品前处理
传统的样品前处理技术包括一系列操作步骤，如匀质化、提取、过滤或离心、柱层析、浓缩和溶剂转换等费时费力的操作，这不仅导致整个方法比较复杂、费时，而且易造成系统误差和偶然误差，因此很长时间以来，样品前处理是农药残留分析工作的瓶颈。

样品测定环节如进样、色谱分离、检测和数据处理等技术，由于计算机、硬件、软件等技术的快速发展，已经高度先进和自动化。

而样前处理技术的发展却是相当缓慢。

究其原因，主要是因为许多研究机构认为样品前处理的技术水平不高，不愿意花时间和精力来改进。

有些较大的仪器厂家不愿意开发自动化样品前处理设备，而规模较小、技术较差的厂家很难生产出实用的设备。

加上农药残留样品基质复杂，其难度妨碍了进行此项基本研究。

第一节样品提取
样品提取是用溶剂将农药从样品中提取出来的步骤，样品的提取过程实验上也起到了样品净化的目的。

在农药残留分析时样品中农药残留量极低，而各种样品中的干扰物质多而
复杂，因此为满足可靠的定性、定量分析需要，首先应将农药从试样中提取出来，然后再使用一种或几种净化步骤，经提取净化后，使样品提取液达到可以进行仪器测定的要求。

一、样品提取技术
由于试样中农药含量极低，提取效率的高低直接影响结果的准确性。

提取果应根据农药种类、试样类型、试样中脂肪、水分含量和最终测定方法等来选择提取方法和提取溶剂，以便尽可能完全地将农药从试样中提取出来，而尽量少地提取出干扰物质，不同类型样品的提取方法不同，大致可以分为以下几类。

①水样：早期直接用有机溶剂在分液漏斗中以液液分配提取，一般先在水样中添加3%~6%NaCl，待盐全部溶解后，加入水样体积约十分之一的提取溶剂，连续提取2次，合并提取液供纯化或直接测定用；如果试样中农药含量极低，可用大孔聚苯乙烯树脂或活性炭等吸附农药后再洗脱下来。

目前主要根据农药的性质选择使用不同固相萃取小柱富集水样中的农药，经溶剂洗杂质后再将农药洗脱后测定。

②土样：可用混合溶剂或含水溶剂以振荡器或索氏提取器提取。

③作物样品：水果、蔬菜等含水量高的样品切碎后，加入与水相混溶剂或混合溶剂在组织捣碎机中高速捣碎，可使溶剂与微细试样反复接触和萃取。

含脂肪量高的样品、如谷物、豆类、油料作物等经粉碎后放入容器中，加入非极性或极性较小的溶剂振荡提取。

④动物组织样品：一般量少，可以在微型玻璃研磨器将组织研碎后，用溶剂提取后净化，对不易捣碎的动物样品，可以使用消化法，如称取2~3g 样品加入消化液30mL（为60%过氯酸加冰醋酸1：1：配制而成），在沸水浴中消煮约2~3h，稀释后再经液液分配提取。

⑤含糖量较高的样品：一般可以加入一定量水分后再用有机溶剂提取。

经典的提取器见图4-1~图4-4有振荡器、索氏提取器（Soxhlet apparatus），也通常使用组织捣碎机，在捣碎样品时加入提取溶剂，将捣碎与提取操作合并进行。

二、提取溶剂
大多数化学农药物理和化学性质接近，相对分子质量大多在150~450之间，常用农药具有C1、P、N等功能元素。

含有这些元素的溶剂使用时应特别注意，有些必须在仪器测定进样前去除。

目前常用的提取溶剂主要有丙酮、乙腈、乙酸乙酯、石油醚或正己烷、甲醇和二氯甲烷等。

三、农药多残留分析方法的提取溶剂
为了适应大量检测样品的挑战，近40多年来各国开发了多种农药多残留分析方法，其目的就是在一次分析中能够同时测定多种农药。

如果不使用多残留方法，残留分析工作者要面临数百种单个农药的残留分析，而且有些方法还很相似。

目前国内外已经开发出多种可以测定数百种农药在蔬菜水果或粮食中的农药多残留方法。

但是多残留分析方法也是有一定限度的，不可能开发出一个适合所有农药/食品或农产品组合的提取和净化方法，多组分的残留分析方法中农药的回收率和精密度也不可能都达到完全满意。

农产品和食品中农药的种类很多，相对分子质量大多在150~450之间（较大相对分子质量的如阿维菌素等除外），绝大多数农药物理和化学性质接近。

如各种农药的极性是有区别的，但是从表4-3农药lgK ow可以看出，农药偏极性的较多，而且常用农药具有C1、P1N 等功能元素。

各种不同的有机溶剂或其不同的组合都可用来从样品中提取具有不同理化性质的农药，但是丙酮、乙腈和乙酸乙酯是过去和现在在各国的数百个实验对极性和非极性农药在许多农产品的多残留测定中用多的三种溶剂，它们的性质各有特点与缺点，如大量水分，在进入色谱系统测定前，必须除去水分；乙酸乙酯与水的可混溶性较差。

至今，还很难决定那个是最合适的溶剂。

以下分别介绍在农药多残留分析中最常用的几种溶剂的特点。

1．乙腈
乙腈沸点为80.1℃，是常用的液相色谱流动相，作为提取溶剂美国和加拿大等国用得最早最多。

乙腈可以溶解并提取各种极性与非极性农药，能与水混溶，与果蔬样品混合匀浆
后，提取液中有水分，但比较容易用盐析出，离心或用分液漏斗后与水分离，可定量取出乙腈提取液。

乙腈极性较大，不易与非极性溶剂混匀，一些非极性的杂质如油脂、蜡质和叶绿素等不会与农药一起被提取出来，提取出的样品杂质较丙酮和乙酸乙酯少，在固相萃取和反相液相色谱上用得较多。

其缺点是比较贵，毒性比其他两种溶剂大，在气相色谱测定时液气的转换膨胀体积较大，应限制进样体积。

2．丙酮
丙酮沸点56.2℃，是最常用的易挥溶剂，可以溶解并提取极性和非极性农药，能与水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿等混溶，但不易与水分开，不易用盐析出其中的水分，是在液液分配中最常用的与水相溶的有机溶剂之一，提出的杂质较乙腈多，相比于乙腈和乙酸乙酯，价格便宜、毒性小。

20世纪中后期我国在单个农药残留及多残留分析方法中广泛应用。

3．乙酸乙酯
乙酸乙酯沸点为77.1℃，作为提取溶剂在欧盟国家、FAO、IAEA等机构使用很多。

乙酸乙酯可以溶解并提取各种极性与非极性农药，微溶于水，其主要特点是与果蔬样品混合匀浆后，在提取液中添加无机盐类，可以盐析出乙酸乙酯层，很容易除去提取液中的微量水分，不需进行液液分配，有时与水完全分离需离心，可取出定量提取液。

与丙酮、乙腈相比其极性小，因此在提取油性样品时，可将一些非极性亲脂性干扰物质提取出来，其缺点是提取出的样品杂质较乙腈多，有怪香不好闻。

第三节样品净化
使用有机溶剂提取样品中的农药时，样品中的油脂、蜡质、蛋白质、叶绿素及其他色素、胺类、酚类、有机酸类、糖类等会同农药一起被提取出来。

提取液中既有农药又有许多干扰物质，这些物质亦称共提物，会严重干扰残留量的测定。

共提物的含量很高，可以用百分数来表示，而待测农药的含量很低，通常为百万分之几，仅占提取物中极小一部分。

样品净化是从待测样品提取液中将农药与杂质分离并除去杂质的步骤。

农产品中一般都含有数量不等的脂肪、水、糖等，还有色素等其他物质（见表4-8~表4-10）
净化过程中在去除这些杂质时，常常会伴随农药丢失，所以样品净化是农药残留分析中难度较大的亦是最重要的步骤之一，是残留分析成败的关键。

净化过程中主要使用分离技术，在农药残留分析中使用的净化技术涉及分离学科的许多领域，并且随着新技术的发展而不断更新。

这种分离和浓缩技术，主要是基于混合物中各组分不同的理化性质，如挥发性、溶解度、电荷、分子大小、分子的开关和极性的不同，在两个物相间转移。

但对于多组分样品，需要较复杂的分离技术，通常从互不相溶的两相中进行选择性转移。

所有的分离技术都包含一个或几个化学平衡，分离的程度会随着实验条件而变化，不能单纯依赖理论，需多次实践才能达到理想的分离效果。

常用的两相分离相技术见表4-11。

一、液液分配萃取法
（一）液液分配萃取法
利用样品中的农药和干扰物质在互不相溶的两种溶剂（溶剂对）中分配系数的差异，进行分离和净化的方法。

通常使用一种能与水相溶的极性溶剂和另一种不与水相溶的相极性溶剂配对来进行分配，这两种溶剂为溶剂对。

经过反复多次分配使试样中的农药残留与干扰杂质分离，样品得到净化。

如选用合适溶剂提取，则提取溶剂亦是液液萃取的溶剂对。

早期一般按以下原则选择溶剂对：含水量高的样品，则先用极性溶剂提取；非极性和含油量高的样品，则先用非极性溶剂，或用乙腈或二甲基甲酰胺等提取。

1．常用的溶剂系统
（1）含水量高的样品：先用极性溶剂提取，再转入非极性溶剂中。

①净化有机磷、氨基甲酸酯等级性稍强农药的溶剂对：水-二氯甲烷；丙酮，水-二氯甲。