实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数

在毕赤酵母中，外源基因能够在基因组的同一位点进行多次同源重组，从而插入多个拷贝的外源基因。而高拷贝的外源基因通常会导致其在毕赤酵母中的高表达［1］。比较外源基因在毕赤酵母中表达量的差异时，如比较不同启动子的转录活性时，往往需要检测外源基因的拷贝数，筛选单拷贝整合外源基因的毕赤酵母菌株。目前，在毕赤酵母的研究中，Southern blot 是运用最多的检测外源基因拷贝数的方法［2］。但该方法需要大量的DNA ，工作量大，操作要求高。近年来，荧光定量PCR 技术不断成熟，并已开始用于检测外源基因的拷贝数，如在转基因植物研究领域，已利用该项技术检测外源基因的拷贝

数［3］。但相关文献报道较少。

本文以毕赤酵母中的看家基因GAP （Glycer －aldehyde -3-phosphate dehydrogenase ）为内参，绿色荧光蛋白（GFP ）基因为报告基因，采用双标准曲线实时荧光定量PCR 法，建立了一种测定毕赤酵母中外源基因拷贝数的方法，现报道如下。1.

材料与方法

1.1菌株及质粒

大肠杆菌Top10、毕赤酵母GS115及质粒pPIC3.5K 均购自Invitrogen 公司；含GFP 基因的毕赤酵母GS115-KDR -P 菌株由本室保存；pMD19-T Simple 载体购自TaKaRa 公司。1.2主要试剂及仪器

Premix Taq （Ex Taq TM Version ）和连接试剂DNA

作者单位：华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室（上海200237）.

通讯作者：周祥山，E -mail ：xszhou@

中国图书分类号Q789文献标识码A

文章编号1004-5503（2009）12-1236-05

【实验技术】

实时荧光定量PCR 检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数

宣姚吉

周祥山

张元兴

【摘要】目的建立实时荧光定量PCR 检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的方法。方法采用双标准曲线法，分别利用含有GAP 基因和绿色荧光蛋白

（GFP ）基因的质粒，进行实时荧光定量PCR 反应，建立标准曲线。将含有外源GFP 基因的毕赤酵母基因组进行实时荧光定量PCR ，通过标准曲线计算出外源GFP 基因在毕赤酵母基因组中的拷贝数。结果

毕赤酵母

GAP 基因Ct 值与起始拷贝数对数的回归方程为：y =-3.612x +39.28，GFP 基因Ct 值与起始拷贝数对数的回归方程为：y =-3.544x +37.99，GAP 基因和GFP 基因的反应效率分别为0.89和0.90，两条标准曲线的相关系数均为0.999，且均有良好的重复性。检测10个转入GFP 基因的毕赤酵母菌株，筛选到9个单拷贝整合GFP 基因的菌株和1个多拷贝整合GFP 基因的菌株。结论已建立了检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR 法，该方法能够筛选出不同外源基因拷贝数的毕赤酵母菌株。

【关键词】实时荧光定量PCR ；毕赤酵母；基因拷贝数

Determination of Copy Number of Foreign Gene in Genome of Pichia pastoris

by Real -time Fluorescent Quantitative PCR

XUAN Yao -ji,ZHOU Xiang -shan,ZHANG Yuan -xing （State Key Laboratory of Bioreactor Engineering ,East Chi －na University of Science and Technology ,Shanghai 200237,China ）

【Abstract 】Objective To develop a method for determination of the copy number of foreign gene in genome of Pichia pastoris by real -time fluorescent quantitative PCR.Methods

The standard curves of GAP and GFP genes were generated with the plasmids

containing GAP and GFP genes respectively,and the genomic DNA of P.pastoris transformants containing GFP gene was analyzed by real -time fluorescent quantitative PCR.The copy number of GFP gene in each transformant was calculated with the Ct value of P.pastoris genomic DNA and the standard curve.Results The regression equation of Ct value and logarithm of original copy number of GAP gene was y =-3.612x +39.28,while that of GFP gene was y =-3.544x +37.99.The reaction efficiencies of GFP and GAP genes were 0.89and 0.90respectively.However,both the correlation coefficients of standard curves of the two genes were 0.999,and both the curves showed good reproducibility.Of the ten P.pastoris transformants tested,nine contained one copy and one contained multiple copies of GFP gene.Conclusion

A real -time fluorescent quantitative PCR method was successfully developed,

which might be used for screening of P.pastoris transformants containing various copies of foreign genes.【Key words 】Real -time fluorescent quantitative PCR;Pichia pastori s;Gene copy number