细胞P300CBP组蛋白乙酰转移酶(P300CBP-HAT)活性

细胞P300/CBP组蛋白乙酰转移酶（P300/CBP-HAT）活性光度法（340nm）
定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
细胞P300/CBP组蛋白乙酰转移酶（P300/CBP-HA T）活性光度法（340nm）定量检测试剂是一种旨在通过通用底物H3多肽，在敏感性抑制剂存在与否的情况下，通过P300/CBP的作用，将乙酰辅酶A上的乙酰基团，转移到多肽分子上的过程中，释放出巯基辅酶A，进而使用α-酮戊二酸脱氢酶反应系统中伴随的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的还原反应，即采用光度法测定其还原后峰值的变化，来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、核蛋白样品、部分或完全纯化酶样品中P300/CBP HA T的特异活性检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。

产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景
核小体（nucleosome）是染色质的最小结构单位，由组蛋白H2A-H2B双体和H3-H4双体构成的组蛋白八体结构（octamer），外层涵盖146碱基DNA。

其结构中组蛋白N末端为游离状态，且高度进化保留，在特定氨基酸部位发生诸如甲基化、乙酰化、磷酸化修饰，以改变其电荷和功能。

组蛋白上特定赖氨酸残基的ε氨基基团的乙酰化通过组蛋白乙酰转移酶（Histone Acetyltransferase；HA T；EC2.3.1.48）催化产生，具有表观遗传学的调节作用，达到染色体重构（remodeling），染色质松弛打开，促使基因转录。

其功能异常将导致肿瘤、神经退行性疾病、AIDS和炎症。

组蛋白乙酰转移酶，又称为赖氨酸乙酰转移酶（lysine acetyltransferase）；KAT），分成二型，细胞核内的A型，包括P300/CBP、Gcn5、TAFII250等，和细胞浆内的B型，例如Hat1。

其又分成六类：P300/CBP（P300/cAMP Responsive Element-Binding Protein），包括P300、CBP等；GNAT（Gcn5-related N-acetyltransferase），包括Gcn5、PCAF、Hat1、Elp3、Hpa2、Hpa3、A TF-2、Nut1等；MYST（MOZ、ybf2/sas3、sas2、Tip60），还包括Esa1、MOF、MORF、HBO1等；核受体共激活因子（nuclear receptor co-activator），包括SRC-1、SRC-3、ACTR、TIF2；TAFII250（TATA box binding protein associated factor）；TFIIIC（transcriptional factor IIIC）等。

其中P300/CBP家属中包括P300、CBP、和P300/CBP 相关因子（P300/CBP Associated Factor；PCAF），这是第一个发现的组蛋白乙酰转移酶，成为结构、机制和功能研究的代表。

P300（又称为KAT3B），E1A肿瘤结合蛋白和CBP（又称为KA T3A），cAMP反应元素结合蛋白（cAMP Responsive Element-Binding Protein；CREB）是全面性转录共激活因子（global transcription coactivator），位于核内，属于旁系同源（paralogue）蛋白，功能相等，序列相似，相同的结构域（包括核受体结合结构域、锌指（zinc finger）结构域、溴区结构域（bromodomain）、内部大乙酰转移酶结构域等），具有内生性乙酰转移酶活性，乙酰化组蛋白和非组蛋白，与300多个DNA结合性转录因子、病毒转化因子、核受体、信号分子等反应、其功能在于调节细胞周期和细胞分化、控制细胞生长和凋亡、整合多种转录水平信号依赖性通路（例如G蛋白通路）、修正基因表达、DNA修复和复制、蛋白间反应和蛋白稳定性，作用于胚胎发育尤其是器官生成，以及调节造血干细胞、神经突触活性和长期记忆形成等。

P300和CBP异常，会导致肿瘤发生和发展、糖尿病、哮喘、髓细胞白血病（myeloid cell leukemia）、阔拇指巨趾综合征（Rubinstein-Taybi syndrome）。

基于底物H3组蛋白多肽Ac-Gln-Thr-Ala-Arg-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly-Lys-Ala-
（H3组蛋白N末端5至23氨基酸残基），在P300/CBP敏感性抑制剂C646 Pro-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Thr- Lys-NH
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存在与否的情况下，通过P300/CBP的作用，将乙酰辅酶A上的乙酰基团，转移到多肽分子上，由此产生乙酰化多肽和巯基辅酶A（CoA-SH），进而通过α-酮戊二酸脱氢酶（α-ketoglutarate dehydrogenase）反应系统中，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）还原为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析P300/CBP组蛋白乙酰转移酶的特异活性。

其反应系统为：
产品内容
裂解液（Reagent A）毫升
分离液（Reagent B）毫升
清理液（Reagent C）毫升
萃取液（Reagent D）毫升
缓冲液（Reagent E）毫升
反应液（Reagent F）微升
底物液（Reagent G）微升
专性液（Reagent H）微升
阴性液（Reagent I）微升
产品说明书1份
保存方式
保存反应液（Reagent F）、底物液（Reagent G）和专性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月
用户自备
磷酸盐缓冲溶液（PBS）：用于清洗细胞样品
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
96孔板或200微升1厘米光径比色皿：用于反应和光度分析的容器
酶标仪或分光光度仪：用于光度分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。

然后进行下列操作。

一、样品准备
1．准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
2．小心抽去培养液
3．小心加入10毫升用户自备的磷酸盐缓冲溶液（PBS），覆盖生长表面
4．小心抽去清理液
5．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
6．加入xx毫升裂解液（Reagent A），混匀细胞
7．移入到预冷的15毫升锥形离心管
8．强力涡旋震荡10秒
9．置于冰槽里孵育15分钟
10．加入xx毫升预冷的分离液（Reagent B），混匀
11．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1300g
12．小心抽去上清液
13．加入xx毫升预冷的清理液（Reagent C）
14．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1300g
15．小心抽去上清液
16．小心加入xx微升预冷的萃取液（Reagent D），混匀
17．转移到新的预冷的1.5毫升离心管
18．超声处理30秒：功率100瓦，10秒一次，间隔2分钟，重复2次（注意：保持在冰槽里）
19．置于冰槽里孵育30分钟
20．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）21．小心移取上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
22．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）23．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1．准备好待测样品（例如核蛋白或纯化酶样品等），置于冰槽里
2．设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长340nm，间隔2分钟，读数6次（共10分钟），并置零3．缓冲液（Reagent E）置于室温下均衡温度
三、样品总活性测定
1．加入xx微升缓冲液（Reagent E）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（Reagent F）
3．加入xx微升底物液（Reagent G）
4．在30℃温度下孵育3分钟
5．加入xx微升阴性液（Reagent I）
6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7．即刻放进分光光度仪检测，获得背景读数（10分钟读数－0分钟读数）
四、样品总活性测定
1．加入xx微升缓冲液（Reagent E）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（Reagent F）
3．加入xx微升底物液（Reagent G）
4．在30℃温度下孵育3分钟
5．加入10微升待测样品（注意：50微克核蛋白；样品须清澈）
6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7．即刻放进分光光度仪检测，获得样品总活性读数（10分钟读数－0分钟读数）
五、样品非特异活性测定
1．加入xx微升缓冲液（Reagent E）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（Reagent F）
3．加入xx微升底物液（Reagent G）
4．加入xx微升专性液（Reagent H）
5．在30℃温度下孵育3分钟
6．加入10微升待测样品（注意：50微克核蛋白；样品须清澈）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，获得样品非特异活性读数（10分钟读数－0分钟读数）
六、计算样品实际活性
1）总活性和非特异活性
2）样品特异活性
注意事项
1．本产品为20次操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．样品须澄清，至关重要
4．样品处理时，避免使用巯基乙醇、DTT等
5．孵育反应完成后即刻进行光度测定
6．测定值由低到高变化
7．测定值读数越高，表明酶活性越高
8．光度测定后，比色皿须清洗彻底
9．待测样本为核蛋白样品，其蛋白浓度为50微克/10微升（本公司提供Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
10．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
11．P300/CBP组蛋白乙酰转移酶单位活性定义为：在30℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够还原1微摩尔NAD所需的酶量作为一个活性单位
12．本公司提供系列组蛋白乙酰转移酶检测试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感。