荧光法测定维生素B_2含量
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荧光法测定维生素 ห้องสมุดไป่ตู้量
【摘要】维生素 是人体必须的营养营养物质之一，为体内黄酶类辅基的组成部分，在人体内具有长大的生理意义。本实验通过荧光法测定标准维生素 的溶液的荧光强度，从而获取其浓度与荧光强度的线性关系，进而通过测定未知样的荧光强度来对维生素 的含量进行定量分析。
【关键词】荧光法、维生素 、含量
2、实验原理
维生素B2是橘黄色无臭的针状结晶，化学名称为7,8-二甲基-10-(1’-D-核糖醇基)异咯嗪，其结构式为：
由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。维生素 易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定，在碱性溶液中较易被破坏。
维生素 溶液在450~470nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近。维生素 在pH＝6~7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素 溶液浓度呈线性关系（在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：F=Kc），因此可以用荧光光度法测维生素 的含量。维生素 在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素 的荧光强得多，故测维生素 的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。
3.2.3、 激发光谱和荧光发射光谱的绘制（用3.00 mL 的标准溶液）
设置λem=520 nm为发射波长，在250~400 nm波长范围内扫描，记录520 nm波长处荧光发射强度和激发波长的关系曲线，得到激发光谱，记录最大激发波长。
根据在激发光谱上获得的最大激发波长设置λex，在400~600 nm波长范围内扫描，记录各个波长处荧光的发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱，从荧光发射光谱上找出其最大的发射波长λem。
荧光分析的石英皿是四面透光的，紫外分析的比色皿两面透光不同，这样的设计是根据光谱性质的不同而设计的，紫外可见吸收光谱是测的样品的吸收，经过样品吸收的光谱，只有直射到检测元件上，才能知道什么样性质的光被样品吸收；而荧光光谱测的是发射光谱，是样品吸收紫外光谱后又以荧光的形式发射出来，可以在不同的方向上发射。为了避免激发光源的干扰，所以检测器与激发光谱的方向呈90度。因此，为了检测方面，荧光比色皿是四通透的。拿的时候不能接触到四个透光面，只能拿上下角部，擦外壁残留液时由于擦镜纸不吸水，故可先用吸水纸巾擦干，再用擦镜纸擦。否则会干扰荧光分析法的实验结果。配置好的溶液也需要尽快测量，以免影响实验结果，对分析造成干扰。对荧光法造成干扰的因素还有样品的测定次序和样品浓度。测定次序应从稀溶液到浓溶液，以减少误差。测试样品时，浓度不易过高，否则由于存在荧光猝灭效应，样品浓度与其荧光强度不呈线性关系，造成较大的测量误差。配置测试样品时，其浓度所测得的荧光值应在标准曲线的线性范围内。
4、数据处理
激发光谱
由仪器所测得λex=376.6nm
荧光光谱
由仪器所测得λem=534.5
λem=534.5 λem=534.5，标准溶液的荧光发射强度数据如下
浓度（mg/mL）
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
未知样
荧光强度
52.4
107.1
164.7
204.8
240.9
185.547
标准曲线
其线性关系式y=4.747x+11.57， =0.9897.
3.2.4、 标准溶液及样品的荧光测定
根据实验获得的荧光激发光谱和发射光谱中的最大激发波长λex和最大发射波长λem，设置为测定时使用的激发波长和发射波长，测量上述系列标准溶液的荧光发射强度，按浓度从从低到高测定。在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素 的浓度。
退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。
（2）待测溶液配制：取适量维生素 片剂，用1%乙酸溶液溶解，在1L容量瓶中定容。取2.00 mL待测溶液于50 mL的容量瓶中，用1%乙酸稀释至刻度，摇匀。
3.2.2、 仪器准备
（1）按照荧光分光光度计的操作规程开好仪器。打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器。
（2）在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数，如灵敏度、狭缝宽度、扫描速度、纵坐标和横坐标间隔及范围等。具体的操作将根据使用仪器型号的不同有所不同，请参照相关仪器的使用说明。
将y=185.547代入上式，得x=0.37mg/mL
5、实验结果分析
荧光法是在入射光的直角方向测定荧光强度，即在黑背景下进行检测，因此可以通过入射光强度或者增大荧光或者磷光信号的放大倍数来提高灵敏度，而紫外-可见法中测定的参数是吸光度，该值与入射光强度和透射光强度的比值相关。荧光分析法属于发光分析，只有待测物分子可以发出指定波长的荧光，紫外可见分光光度法属于吸光分析，除待测物之外，其它物质也可能对入射光产生吸收，和波长没有关系。
3、荧光法测定维生素
3.1、仪器试剂
仪器：荧光分光光度计（天津港东280型），石英比色皿
试剂：维生素 ，乙酸
3.2、实验步骤
3.2.1、 配制系列标准溶液和待测溶液
（1）标准溶液配制：取维生素 （5.0 mg/mL）标准溶液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL分别置于50 mL的容量瓶中，用1%乙酸稀释至刻度，摇匀。
1、引言
维生素 (又叫核黄素，V )为体内黄酶类辅基的组成部分（黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用），当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。其病变多表现为口、眼和外生殖器部位的炎症，如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等，故维生素 可用于上述疾病的防治。体内维生素 的储存是很有限的，因此每天都要由饮食提供。
【摘要】维生素 是人体必须的营养营养物质之一，为体内黄酶类辅基的组成部分，在人体内具有长大的生理意义。本实验通过荧光法测定标准维生素 的溶液的荧光强度，从而获取其浓度与荧光强度的线性关系，进而通过测定未知样的荧光强度来对维生素 的含量进行定量分析。
【关键词】荧光法、维生素 、含量
2、实验原理
维生素B2是橘黄色无臭的针状结晶，化学名称为7,8-二甲基-10-(1’-D-核糖醇基)异咯嗪，其结构式为：
由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。维生素 易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定，在碱性溶液中较易被破坏。
维生素 溶液在450~470nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近。维生素 在pH＝6~7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素 溶液浓度呈线性关系（在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：F=Kc），因此可以用荧光光度法测维生素 的含量。维生素 在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素 的荧光强得多，故测维生素 的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。
3.2.3、 激发光谱和荧光发射光谱的绘制（用3.00 mL 的标准溶液）
设置λem=520 nm为发射波长，在250~400 nm波长范围内扫描，记录520 nm波长处荧光发射强度和激发波长的关系曲线，得到激发光谱，记录最大激发波长。
根据在激发光谱上获得的最大激发波长设置λex，在400~600 nm波长范围内扫描，记录各个波长处荧光的发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱，从荧光发射光谱上找出其最大的发射波长λem。
荧光分析的石英皿是四面透光的，紫外分析的比色皿两面透光不同，这样的设计是根据光谱性质的不同而设计的，紫外可见吸收光谱是测的样品的吸收，经过样品吸收的光谱，只有直射到检测元件上，才能知道什么样性质的光被样品吸收；而荧光光谱测的是发射光谱，是样品吸收紫外光谱后又以荧光的形式发射出来，可以在不同的方向上发射。为了避免激发光源的干扰，所以检测器与激发光谱的方向呈90度。因此，为了检测方面，荧光比色皿是四通透的。拿的时候不能接触到四个透光面，只能拿上下角部，擦外壁残留液时由于擦镜纸不吸水，故可先用吸水纸巾擦干，再用擦镜纸擦。否则会干扰荧光分析法的实验结果。配置好的溶液也需要尽快测量，以免影响实验结果，对分析造成干扰。对荧光法造成干扰的因素还有样品的测定次序和样品浓度。测定次序应从稀溶液到浓溶液，以减少误差。测试样品时，浓度不易过高，否则由于存在荧光猝灭效应，样品浓度与其荧光强度不呈线性关系，造成较大的测量误差。配置测试样品时，其浓度所测得的荧光值应在标准曲线的线性范围内。
4、数据处理
激发光谱
由仪器所测得λex=376.6nm
荧光光谱
由仪器所测得λem=534.5
λem=534.5 λem=534.5，标准溶液的荧光发射强度数据如下
浓度（mg/mL）
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
未知样
荧光强度
52.4
107.1
164.7
204.8
240.9
185.547
标准曲线
其线性关系式y=4.747x+11.57， =0.9897.
3.2.4、 标准溶液及样品的荧光测定
根据实验获得的荧光激发光谱和发射光谱中的最大激发波长λex和最大发射波长λem，设置为测定时使用的激发波长和发射波长，测量上述系列标准溶液的荧光发射强度，按浓度从从低到高测定。在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素 的浓度。
退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。
（2）待测溶液配制：取适量维生素 片剂，用1%乙酸溶液溶解，在1L容量瓶中定容。取2.00 mL待测溶液于50 mL的容量瓶中，用1%乙酸稀释至刻度，摇匀。
3.2.2、 仪器准备
（1）按照荧光分光光度计的操作规程开好仪器。打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器。
（2）在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数，如灵敏度、狭缝宽度、扫描速度、纵坐标和横坐标间隔及范围等。具体的操作将根据使用仪器型号的不同有所不同，请参照相关仪器的使用说明。
将y=185.547代入上式，得x=0.37mg/mL
5、实验结果分析
荧光法是在入射光的直角方向测定荧光强度，即在黑背景下进行检测，因此可以通过入射光强度或者增大荧光或者磷光信号的放大倍数来提高灵敏度，而紫外-可见法中测定的参数是吸光度，该值与入射光强度和透射光强度的比值相关。荧光分析法属于发光分析，只有待测物分子可以发出指定波长的荧光，紫外可见分光光度法属于吸光分析，除待测物之外，其它物质也可能对入射光产生吸收，和波长没有关系。
3、荧光法测定维生素
3.1、仪器试剂
仪器：荧光分光光度计（天津港东280型），石英比色皿
试剂：维生素 ，乙酸
3.2、实验步骤
3.2.1、 配制系列标准溶液和待测溶液
（1）标准溶液配制：取维生素 （5.0 mg/mL）标准溶液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL分别置于50 mL的容量瓶中，用1%乙酸稀释至刻度，摇匀。
1、引言
维生素 (又叫核黄素，V )为体内黄酶类辅基的组成部分（黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用），当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。其病变多表现为口、眼和外生殖器部位的炎症，如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等，故维生素 可用于上述疾病的防治。体内维生素 的储存是很有限的，因此每天都要由饮食提供。