天麻钩藤饮干预肾血管性 高血压大鼠心肌胶原重构的研究

广东省教育厅资助项目(0115)
天麻钩藤饮干预肾血管性
高血压大鼠心肌胶原重构的研究
胡世云1 赵立诚2 冼绍祥2 李南夷2
(广东省中医院心脏中心,510120,广东广州;2.广州中医药大学第一附属医院,512405,广东广州)
摘 要:目的:探讨天麻钩藤饮对肾血管性高血压大鼠(RHR)胶原重构的影响。

方法:采用经典的肾动脉钳夹方法建立RHR模型。

将RHR随机分为3组。

于术后5周开始给药,持续治疗8周,然后处死动物。

给药方法:模型组7只:注射用水2ml/100g体重灌胃,每天1次。

天麻钩藤饮组8只:天麻钩藤饮2ml/100g 体重灌胃,每天1次(每ml含生药1g)。

巯甲丙脯酸组9只:巯甲丙脯酸10mg/100g体重灌胃,每天1次。

假手术组8只:除不夹肾动脉外,均与模型组相同。

观测大鼠胶原浓度,Ⅰ、Ⅲ型胶原含量,心脏重量,左心室重量。

结果:天麻钩藤饮和巯甲丙脯酸均能明显降低肾血管性高血压大鼠LV I水平和胶原的含量(P<0.01);积分法显示天麻钩藤饮组和巯甲丙脯酸组的Ⅰ型胶原含量明显较模型组减少(P<0.05,P<0.01)。

模型组和巯甲丙脯酸组的Ⅲ型胶原含量明显较假手术组增高(P<0.01),天麻钩藤饮组的Ⅲ型胶原含量与假手术组比较无明显差异。

结论:1.天麻钩藤饮与巯甲丙脯酸均能通过降低肾血管性高血压大鼠LV I水平和胶原的含量来干预心肌纤维化。

2.巯甲丙脯酸通过降低Ⅰ型胶原的含量,达到降低胶原浓度的作用来干预心肌纤维化;而天麻钩藤饮可通过同时降低Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量,达到降低胶原浓度的作用来干预心肌纤维化。

其中两者对Ⅰ/Ⅲ型胶原比例是否降低还值得进一步研究。

故认为天麻钩藤饮与巯甲丙脯酸干预高血压心肌纤维化的机理有所不同,这可能与中医药的多层次、多靶点的作用机制有关。

关　键　词:天麻钩藤饮; 胶原; 肾血管性高血压
中图分类号:R255.1 文献标识码:A 文章编号:1009-5276(2004)09-1658-03
高血压病引起的心脏病理改变主要是心肌实质重构和间质重构。

以往对心肌间质重构缺乏足够认识和重视。

本文研究目的是在天麻钩藤饮的干预下,观察二肾一夹肾血管性高血压大鼠(RHR)心肌间质胶原水平的变化,阐明天麻钩藤饮能否逆转RHR心肌纤维化。

1　材料与方法
实验药品　中药及制备:天麻钩藤饮:天麻9g,钩藤(后下)12g,石决明(先煎)18g,山栀9g,黄芩9g,川牛膝12g,杜仲9g,益母草9g,桑寄生9g,夜交藤9g,茯苓9g。

经广州中医药大学第一临床医学院中药房鉴定均为正品。

水提浓缩,相当于每ml含生药1g,4℃保存。

西药及制备　巯甲丙脯酸:常州制药厂的产品,批号312101。

双蒸水溶解提取,相当于每ml含生药5mg,4℃保存。

试剂盒　心肌组织羟脯氨酸测试盒由南京建成生物工程研究所提供。

Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化试剂盒由武汉博士德生物有限公司提供。

动　物　选用正常雄性SD大鼠55只(广州中医药大学实验动物中心提供),体重90～120g。

RHR模型　采用经典的肾动脉钳夹方法。

若术后血压大于术前的3个标准差且高于115mmHg,则确定模型建立〔1〕。

假手术组仅游离肾动脉,不套上银夹。

实验设计　将RHR随机分为3组。

于术后第5周开始给药,持续治疗8周,处死动物。

模型组:注射用水2ml/100g体重灌胃,每天1次。

天麻钩藤饮组:天麻钩藤饮2ml/100g体重灌胃,每天1次(每ml含生药1g)。

巯甲丙脯酸组:巯甲丙脯酸10mg/100g体重灌胃,每天1次。

假手术组:除不夹肾动脉外,均与模型组相同。

血压的测量　采用尾袖法,血压仪为大鼠电脑血压心率仪(RBP-1大鼠血压仪,中日友好医院研制)。

于上午9时测定大鼠清醒状态下的尾动脉收缩压,连测3次,取平均值。

心脏重量、左心室重量(LVW)、左心室重量指数(LV I=左心室重量/体重)　实验结束时大鼠称重,断头处死,取出心脏,4℃预冷生理盐水冲洗血污,滤纸吸干称重。

沿房室交界处去除心房和大血管,去除右心室游离壁,分离左心室并称重,以此作为LVW,并计算LVW/ BW。

然后立即置液氮中冷冻,-70℃保存待测。

胶原浓度(Coll)　采用南京建成生物工程研究所提供的羟脯氨酸测试盒测定心肌羟脯氨酸浓度。

算出羟脯氨酸含量,然后乘以8.2,算出胶原浓度。

免疫组化(SABC)检测基质中Ⅰ(Ⅲ)型胶原　大鼠心脏生理盐水冲洗,置10%福尔马林固定48～72h,常规石蜡包埋。

取左室中断横截面,4um厚连续切片。

然后采用武汉博士德生物有限公司提供的试剂盒及程序进行石蜡切片染色,脱水,透明,封片。

显微镜观察。

结果评定参照郑金旭〔2〕标准并稍作修改:1分,极少量.低倍镜下看不到,高倍镜下明确可见;2分:少量,低倍镜下隐约可见,高倍镜下明确可见;3分:中量,低倍镜下清晰可见;4分:大量,成束状或小堆状;5分:大片状分布。

统计学分析:测定数据以均差±标准差( X±S)表示;计量资料采用t检验,F检验。

计数资料采用卡方检验。

第22卷　第9期2004年9月
中　医　药　学　刊
CHI NESE　ARCHI VES　OF　TRADITIONA L　CHI NESE　MEDICI NE
Vol.22No.9
Sep.2004
中医药
1658　学刊
2　结　果
一般情况　术前55只SD大鼠,其中10只仅游离肾动脉,不套上银夹,作为假手术组;45只进行肾动脉钳夹术,术后存活39只。

术后1周,有35只大鼠形成高血压,形成率为89.74%,此后血压一直稳定在较高的水平。

术后第5周,随机分为模型组11只,天麻钩藤饮组12只,巯甲丙脯酸组12只。

术后第8周,实验结束时,假手术组存活8只,模型组存活7只,天麻钩藤饮组存活8只,巯甲丙脯酸组存活9只。

死亡原因:假手术组术后感染死亡1只,灌胃死亡1只;模型组灌胃死亡1只,脑出血死亡3只;天麻钩藤饮组灌胃死亡4只;巯甲丙脯酸组灌胃死亡3只。

对RHR的LV I和胶原水平的影响　见表1。

表1RHR的LVI、胶原水平的变化
组别例数LVI(mg/g)coll(mg/g.wet.wt)模型组7 2.42±0.28 2.62±1.07 假手术组8 1.81±0.32## 2.21±0.32##
天麻钩藤饮组8 2.01±0.17## 2.92±0.44##
巯甲丙脯酸组9 1.93±0.25## 2.78±0.38##
注:与模型组相比,##P<0.01。

表1显示:天麻钩藤饮和巯甲丙脯酸均能明显降低RHR的LV I水平和胶原的含量(P<0.01)。

Ⅰ型胶原半定量分析,见表2。

表2　各组Ⅰ型胶原的积分
组别例数
积分12345
模型组700322
假手术组843100天麻钩藤饮组823210
巯甲丙脯酸组925200
表2显示:假手术组、天麻钩藤饮组和巯甲丙脯酸组的Ⅰ型胶原含量明显较模型组减少(P<0.01,P<0.05,P<0.01),而三组之间无明显的差异。

说明天麻钩藤饮和巯甲丙脯酸可以减少Ⅰ型胶原在RHR心肌的沉积。

Ⅲ型胶原半定量分析　见表3。

表3　各组Ⅲ型胶原的积分
组别例数
积分12345
模型组701321
假手术组843100天麻钩藤饮组812410
巯甲丙脯酸组902430
表3显示:模型组和巯甲丙脯酸组的Ⅲ型胶原含量明显较假手术组增高(P<0.01),天麻钩藤饮组的Ⅲ型胶原含量与假手术组比较无明显差异。

说明天麻钩藤饮可以减少Ⅲ型胶原在RHR心肌的沉积。

3　讨　论
高血压引起的主要心脏病理改变不仅指心肌细胞的肥大,而且还包括心肌纤维化(MF)和冠状微血管的结构改变〔3〕,研究表明:由此引起心功能障碍,与心肌间质胶原堆积,间质重建,形成MF有关〔4、5〕。

值得注意的是MF和心肌细胞肥厚并非同步发生的。

例如在高血压病中,最初认为左室肥厚(LVH)和MF是心脏对血压增高的代偿反应,但后来发现,临床引起血压增高和LVH的疾病,MF的程度并不相同。

Laviades和章氏发现高血压患者即使左室未见肥厚,但胶原纤维已经出现异常堆积〔6〕。

Brilla研究表明:MF比LVH增加更能决定心脏舒张功能〔7〕。

一般认为,压力负荷过度所致的心脏间质组织增生可以通过降压或其它手段加以抑制和缓解,但不象心肌细胞那样容易得到逆转〔8、9〕。

因此逆转心肌纤维化,改善或恢复心功能,已成为目前抗高血压治疗的重要战略目标。

现代研究表明:RHR是研究心肌纤维化最为典型的动物模型。

在术后4周RHR心肌呈反应性纤维化表现,在术后12周则呈修复性纤维化表现〔10〕。

本实验结果表明:RHR术后12周时LVW为(824.14±95.12)mg,LV I 为(2.42±0.28)mg/g,coll为(5.62±1.07)mg/g.wet. wt,明显高于假手术组(P<0.01);积分法显示Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显增高,证明压力超负荷性左室肥大时,心肌间质胶原合成增加,间质的空间构筑发生了重建,这是左室重构的病理基础之一。

这说明左心室已出现显著肥厚及纤维化,RHR心肌纤维化模型复制成功。

天麻钩藤饮出自《杂病证治新义》,作为运用补肝肾调阴阳法治疗高血压病的代表方,是临床公认的有效降压组方〔11〕。

本实验提示:天麻钩藤饮与巯甲丙脯酸均能通过降低RHR的LV I水平和胶原的含量来干预心肌纤维化。

进一步研究发现,天麻钩藤饮可以同时减少Ⅰ、Ⅲ型胶原在RHR心肌的沉积,而巯甲丙脯酸只可以减少Ⅰ型胶原在RHR心肌的沉积。

彭氏认为高血压左心室肥厚后期主要是心肌胶原的增生和间质结构的改变,以Ⅰ型胶原增生为主,Ⅲ型胶原次之〔12〕。

因此,我们认为巯甲丙脯酸通过降低Ⅰ型胶原的含量,达到降低胶原浓度的作用来干预心肌纤维化;而天麻钩藤饮可通过同时降低Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量,达到降低胶原浓度的作用来干预心肌纤维化。

故我们认为天麻钩藤饮与巯甲丙脯酸干预高血压心肌纤维化的机理有所不同,这可能与中医药的多层次,多靶点的作用机制有关。

参考文献
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　第9期胡世云等:天麻钩藤饮干预肾血管性高血压大鼠心肌胶原重构的研究
中
医
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1659
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刊
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Abstract:Objective:To investigate the effect of Tianma G outeng Decoction on collagen remodeling in renovascular hyperten2 sive rat.Methods:2K1C renovascular hypertensive rats were divided into3groups.The rats were feeding drug5weeks after operation,8weeks of curing,and then the rats were put into death.Feeding methods:Model group(7rats):injection water 2ml/100g rat weight were feed into stomach.The group of Tianma G outeng Decoction(8rats):Tianma G outeng Decoction 2ml/100g weight feeding into stomach,one time a day(There is1g crude medicine per ml).The group of Captopril(9rats): captopril10mg/100g weight feeding into stomach,one time a day.The sham-operation group(8rats):the same as the model group except nipping the nephridium artery.Guideline of observation:collagen concentration,typeⅠ,ⅢCollagen con2 tent,the weight of heart,the weight of left ventricle.Results:1.It showed that Tianma G outeng Decoction and Captopril could both reduce renovascular hypertensive rat’s LV I level and collagen content(P<0.01).2.Integral method indicated Tianma G outeng Decoction group and Captoril group’s content ofⅠcollagen obviously reduced compared with Model group( P<0.05,P<0.01).Model group and Captoril group’s content ofⅢcollagen obviously reduced compared with Sham-op2 eration group(P<0.01)but there was no distinct difference among the Tianma G outeng Decoction group and Sham-oper2 ation group.Conclusion:1.Tianma G outeng Decoction and Captopril can reduce the level of RHR’s LV I and collagen content to interfere with myocardial fibrosis.2.Captopril could reduce collagen consistency by reducing the TypeⅠcollagen content interfering with myocardial fibrosis while Tianma G outeng Decoction could reduce collagen consistency by reducing both the TypeⅠand TypeⅢcollagen content interfering with myocardial fibrosis.There was further research on whether Ca ptopril and Tianma G outeng Decoction can reduce the proportion of TypeⅠand TypeⅢ.S o we think the reasons for Tianma G outeng Decoction and Captopril interfering with hypertensive myocardial fibrosis were different.Maybe it was related to the effect principle of Chinese Medicine’s multi-layer and multi-aim.
K ey words:Tianma G outeng Decoction;　collagen;　renovascular hypertension
(上接第1655页)更加重了“瘀”的存在。

由此因果互生,交错盘结,使病变更加积重难返。

在临床实践中以活血化瘀,软坚散结,攻坚击破,扶正祛邪为原则。

疾病初起时,正气强邪气弱,宜用攻破法;若发病日久,邪气渐深,正气渐弱,则应攻补兼施;倘若久病不愈,正气已衰,宜以扶正为主,待气渐恢复,再议攻伐。

桂枝茯苓丸为张仲景制定的第一个治疗疒徵瘕的方剂,其治则为缓攻法,即以活血化瘀,软坚散结,缓消疒徵块为治法。

方中,桂枝味辛甘而性温,温经通脉而行瘀滞,是为君药;桃仁味苦甘平,为化瘀消疒徵之要药,丹皮味辛苦而性微寒,既能散血行瘀,又能清瘀久所化之热,芍药味苦酸性微寒,能和血养血,与诸祛瘀药合用,有活血养血之功,共为臣药;水为血之侣,用茯苓之甘淡性平,消痰利水,渗湿健脾,以助消疒徵之力,为佐药;以白蜜为丸,取其缓和诸药破泄之力,为使药;诸药相合,共奏活血化瘀、缓消疒徵块之效。

化瘤方以桂枝茯苓丸加味而成,方中重用黄芪,取其味甘而性温,益气升阳,畅通血脉,流行经络,活血生血之功效。

现代药理认为,黄芪具有明显的增强机体免疫功能,提高机体应激能力,增强网状内皮细胞吞噬功能的作用。

桂枝茯苓丸中的丹皮、桃仁、芍药能激活组织对异物的吞噬作用,特别是勺药对巨噬细胞有极
强的活性。

丹皮能通过改善红细胞可变形性及红细胞内粘度,进而降低血液粘度、改善循环、促进化瘀消疒徵作用的发挥。

免疫系统可以通过多种途径影响神经内分泌功能。

免疫细胞本身可以产生和释放内分泌激素,也可以通过它们所产生的细胞因子作用于神经内分泌系统,从而影响全身各系统的功能活动,其中报道较多的有IL-1、IL -2、及干扰素IFN、肿瘤坏死因子TNF。

IL-2、TNF-α皆由免疫活性细胞合成和分泌的一类介导炎症和免疫反应的多肽类蛋白,在宿主抵御组织损伤过程中起重要作用,与临床许多疾病的发生和转归密切相关。

T细胞产生的IL-2,可刺激T细胞表面的IL-2R受体的表达和IL-2的进一步分泌。

IL-2除能刺激T细胞增殖,还能促使CD4++T细胞合成细胞因子,如TNF-α,TNF-β,IFN-γ。

肿瘤坏死因子TNF根据其来源和结构分为两种,即TNF-α和TNF-β,前者由单核巨噬细胞产生,后者由活化的T细胞产生,又名淋巴毒素。

TNF-α具有多种生物学效应,包括介导炎症和免疫反应,促进和抑制多种细胞增生、生血管和细胞毒性作用,调节血管通透性,还能促进颗粒细胞的增生和E2的分泌。

卵巢能分泌TNF -α,并可能受促性腺激素调控。

子宫肌瘤患者血清中IL
中　医　药　学　刊2004年第22卷中
医
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刊。