蛋白质复合体非变性凝胶电泳技术及其应用新进展汇总.

一般认为自身带负电的考马斯亮蓝染料以约 1∶ 1 的 比率结合在蛋白质复合体的表面使其带上负电 。 ［16］ 这样既防止了电泳过程中因缺少去污剂导致的蛋白 质复合体之间的聚集，又因屏蔽了蛋白质复合体的 电荷使复合体在胶体内的迁移率只由分子量决定， 进而提高了非变 性 凝 胶 电 泳 分 离 的 分 辨 率 ［14］。 同 时考马斯亮蓝可以覆盖蛋白质表面的疏水基团，大 大增加了疏水蛋 白 质 的 溶 解 性 ［17］。 由 于 考 马 斯 亮 蓝染料能够结合到酸性 氨 基 酸 上，使 一 些 碱 性 蛋 白 质如 pI = 10 7 的细胞色素 C 也同样可以在中性缓 冲体系 中 向 阳 极 迁 移 。 ［18］ BN-PAGE 电 泳 体 系 中 除了引入考 马 斯 亮 蓝 染 料 外，还 常 使 用 一 些 其 它 试剂来溶解 复 合 体 和 维 持 复 合 体 的 完 整 性，如 使 用中性去污剂和两性离子 6-氨基己酸增加膜蛋白 复合体的溶解性，使用 2，2-双二羟甲基苯胺（ BisTris） 或者咪唑用来维持胶内 pH 值在 7 0 － 7 5 之 间 等 ［19］。
Meng Qingshi1，2 Zhang Guangxiang1 Pan Yinghong2
（ 1 College of Life Sciences，Sichuan Normal University，Chengdu 610101； 2 The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural，Beijing 100081）
张光祥，男，博士，副教授，从事分子生物学研究； E-mail： zhgx-163@ 163. com
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2010 年第 6 期
能 ，对 研 究 植 物 发 育 、分 化 、衰 老 以 及 抗 病 、抗 逆 机 制有着重要的意义。
尽管当前 蛋 白 质 分 离 纯 化 新 技 术 层 出 不 穷， 但是在非变性条件下分离完整蛋白质复合体依然 面临巨大 的 挑 战［9］。基 因 组 分 析 结 果 显 示，膜 蛋 白约占细胞蛋白质种类的 20% － 30% ［10］，具有强 疏水性和丰度低等特点［11］，而蛋 白 质 复 合 体 主 要 由 膜 蛋 白 组 成 ，其 大 小 形 状 、表 面 电 荷 、等 电 点 、疏 水性和丰度 等 各 不 相 同，因 此 无 法 建 立 可 适 用 于 所有的蛋白质复合体分离纯化的通用技术方法。 目前以胶体为介质的基于蛋白质分子电荷和分子 量大小等属性的双向电泳技术（ 2-DE） 在可溶性蛋 白质研究中 被 广 泛 使 用，但 不 适 用 于 蛋 白 质 复 合 体和膜蛋白分离分 析 。 ［12］ 值 得 庆 兴 的 是，近 几 年 逐渐发展 起 来 的 蓝 绿 温 和 非 变 性 凝 胶 电 泳 （ blue native polyacrylamide gel electrophoresis，BN-PAGE） 技术已被成 功 用 于 蛋 白 质 复 合 体 分 离 和 纯 化，成 为当前 研 究 蛋 白 质 复 合 体 的 强 有 力 工 具。 利 用 BN-PAGE 技术，可以得知蛋白质复合体的大小，数 量，复合体 组 成，相 对 丰 度 等 理 化 参 数。例 如，如 果蛋白质Ⅰ和蛋白质Ⅱ都与蛋白质 A 互 作，利 用 BN-PAGE 技术 可 以 将 蛋 白 质 复 合 体 Ⅰ-A-Ⅱ 从 蛋 白质 复 合 体 Ⅰ-A 和 蛋 白 质 复 合 体 Ⅱ-A 中 分 辨 出来 。 ［13，14］
将小麦叶片置液氮充分研磨后用裂解液 （ Bistris 20 mmol / L，ε-aminocaproic acid 500 mmol / L， NaCl 20 mmol / L，EDTA 2 mmol / L，Glycerol 10% ， pH7 0） 4℃ 浸泡 5 min，2 000 × g 离心去细胞核和残 渣，10 000 × g 离心去叶绿体、线粒体等，100 000 × g 超速离心得细胞膜碎片，预冷裂解液重悬细胞膜后 进 行 不 连 续 蔗 糖 密 度 梯 度 离 心，收 集 蔗 糖 浓 度 36% － 45% 间细胞膜碎片并 100 000 × g 超速离心 后得较纯膜碎片，用含 0 5% 非离子去污剂 TritonX100 的预冷裂解液重悬细胞膜碎片，置 4℃ 孵育 1 h， 每隔 15 min 震荡一次； 然后 100 000 × g 超速离心除 去膜碎片，取上清于新的预冷离心管中，样品可直接 用于电泳。 1 2 非变性梯度凝胶制备及电泳
1 BN-PAGE 技术的原理和特点
以常规的非变性凝胶电泳为基础发展起来的 BN-PAGE 技术最主要特点是在阴极缓冲液中引入 了 考 马 斯 亮 蓝 染 料 （ coomassie brilliant blue， CBB） ［13］，在能保持复合体完整性的中性缓冲体系 中分离 100 kD － 10 mD 大小的蛋白质复合体［13 。 － 15］
Abstract： The native polyacrlamide gel electrophoresis is a powerful technique for the study of protein complexes. In this paper， we compared the technical features，advantages，disadvantages and the scope of application of four native electrophoresises which are known as blue native polyacrlamide gel electrophoresis（ BN-PAGE） ，blue native agarose-acrylamide composite gel electrophoresis，clean native polyacrlamide gel electrophoresis（ CN-PAGE） and high resolution clean native polyacrlamide gel electrophoresis（ HrCN-PAGE） . Then we listed the application of this methods in protein complexes research and looked forward to the applications in the plant proteome research.
好地了 解 这 些 细 胞 内 蛋 白 质 复 合 体 的 组 成 及 功
收稿日期： 2010-02-03 基金项目： 国家自然科学基金（ 30971874） ，国家“863”计划项目（ 2008AA10Z115） ，转基因生物新品种培育科技重大专项（ 2009ZX08012-011B） 作者简介： 孟庆石，男，硕士研究生，从事植物蛋白质组学研究； E-mail： mengas84@ gmail. com 通讯作者： 潘映红，男，硕士，研究员，从事植物蛋白质组学研究； E-mail： pyh51@ yahoo. com. cn
剪接体、纺 锤 体、核 孔 结 构、以 及 核 糖 体 等 功 能 单 位的形式 存 在［6］，如 线 粒 体 中 与 呼 吸 作 用 相 关 的 氧化磷酸化复合体 。 ［18］ 同 样，在 植 物 体 亚 细 胞 结
构内也 存 在 大 量 的 具 有 特 殊 功 能 的 蛋 白 质 复 合 体，如在叶 绿 体 内 类 囊 体 中 的 NAD （ P） H 脱 氢 酶 复合体［7］，与 细 胞 壁 合 成 有 关 的 多 糖 蛋 白 质 复 合 体［8］等。利用 非 变 性 技 术 开 展 深 入 研 究，可 以 更
·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2010 年第 6 期
蛋白质复合体非变性凝胶电泳技术及其应用新进展
孟庆石1，2 张光祥1 潘映红2
（ 1 四川师范大学生命科学学院，成都 610101； 2 中国农业科学院作物科学研究所 国家农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程，北京 100081）
BN-PAGE 技术的关键在于低盐样品制备、合理 的选择溶解蛋白质复合体的去污剂和电泳操作。综 合相关文献［13，14，20 － 23］以及本实验室的经验，现以小 麦叶片细胞膜蛋白质复合体分析为例，从样品制备， 凝胶制备，上样，染色分析等方面对 BN-PAGE 技术 的关键步骤进行简要描述。 1 1 膜蛋白质复合体的制备
关键词： 蓝绿温和非变性凝胶电泳 蓝绿温和琼脂糖凝胶电泳 清澈温和非变性凝胶电泳 高分辨清澈温和非变性 凝胶电泳 植物蛋白质复合体
The Technology and the Application of Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis in Protein Complex Research
Key words： BN-PAGE Blue native agarose-acrylamide composite gel electrophoresis CN-PAGE HrCN-PAGE Plant protein complex
在生命过程中多数生理功能并不是由单一蛋 白质独立完 成 的，而 是 由 一 系 列 的 蛋 白 质 以 复 合 体的形式通 过 蛋 白 质 与 蛋 白 质 之 间，或 者 蛋 白 质 与 基 因 的 相 互 作 用 共 同 完 成 ［1］，如 光 合 作 用 ［2］、细 胞壁 生 成［3］、激 素 信 号 传 导［4］和 氧 化 还 原 反 应 等 ［5］。 蛋 白 质 复 合 体 主 要 分 布 于 细 胞 膜 、胞 浆 、线 粒 体 、溶 酶 体 、过 氧 化 物 酶 体 、内 质 网 、细 胞 核 和 高 尔 基 体 等 不 同 细 胞 器 或 细 胞 区 域 中 ，常 以 核 基 质 、
摘 要： 非变性凝胶电泳技术是研究蛋白质复合体的强有力工具。重点介绍了蓝绿温和非变性凝胶电泳（ BN-PAGE） 技术的原理和特点，比较了由 BN-PAGE 衍生的蓝色温和琼脂糖凝胶电泳、清澈温和非变性凝胶电泳（ CN-PAGE） 和高分辨清 澈温和非变性凝胶电泳（ HrCN-PAGE） 技术的差异和适用范围，并概括地介绍了这些技术在植物蛋白质复合体研究中应用的 新进展。
3 × BN 缓冲液（ mL） *
5
40% 丙烯酰胺（ mL）
1 5
5 5 63
3 0 72
用梯度混合仪灌制 4% － 15% 的分离胶，上层 再灌 3 5% 的浓缩胶，配方见表 1。灌制后在 30℃
2010 年第胶电泳技术及其应用新进展
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表 1 非变性梯度 BN-PAGE 胶的配方
分离胶（ 4% ） 分离胶（ 15% ） 浓缩胶（ 3 5% ）
本研究拟综合评述 BN-PAGE 和由其衍生的清 澈温和非变性凝胶电泳（ clean native polyacrylamide gel electrophoresis，CN-PAGE） 与高分辨率清澈温和 非变性凝胶电泳（ high-resolution clear native electrophoresis，HrCN-PAGE） 等非变性电泳技术的原理、特 点和适用范围，并列举上述技术在线粒体、类囊体、 细胞膜、液泡膜等膜系统蛋白质复合体研究中的应 用实例，同时着重介绍该技术在植物蛋白质复合体 研究中应用的新进展。