生物技术 细胞工程

1. 细胞工程概念
广义的细胞工程
包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作 和培养技术 狭义的细胞工程
指细胞融合和细胞培养技术。
1. 细胞工程概念
根据不同的研究层次，细胞工程分为
染色体工程、染色体组工程、细胞质工程、和 细胞融合工程
染色体工程 是按人们需要，添加，削减或替换生物染 色体的技术，根据操作对象的不同，分 为动物染色体工程和植物染色体工程。 染色体组工程 改变染色体组数的技术。如单倍体转变为 多倍体，三倍体西瓜
培养环境条件
光照 强度、光质、光周期

温度 24-28度；最佳24-26度

相对湿度 容器相对湿度高达96%-100%；培养室70%-80%

诱导去分化阶段
使各种细胞重新处于旺盛有丝分裂的分生 状态，培养基中应添加较高浓度的生长素 ，其结果形成愈伤组织。
继代增殖阶段
继代培养
及时分离愈伤组织成适当大小转移到新配 制的培养基上，促进愈伤组织生长增殖。
原生质体A
原生质体B 原生质体融合 正在融合的 原生质体 再生出细胞壁 细胞分裂
杂种细胞
愈伤组织
杂种植株
养培 织 组 物 植
白菜
甘蓝 白菜－甘蓝
3.细胞工程的基础知识
细胞分化和全能性
多细胞生物体是由各种各样形态和功能都不同的细胞
群所组成。高等动、植物由受精卵细胞开始的胚胎发
生过程随着细胞分裂次数的增加而使得早期胚胎的细
外植体
愈伤组织
新植株
1. 植物组织培养
进行植物组织培养，一般要经历以下五个阶段：
1.预备阶段； 2.诱导去分化阶段； 3.继代增殖阶段； 4.生根成芽阶段； 5.移栽成活阶段。
预备阶段
(1) 选择合适的外植体；
外植体的部位、年龄及大小。 (2) 除去病原菌及杂菌； 对外植体除菌的一般程序如下： 外植体 自来水多次漂洗 消毒剂处理 无菌水反复冲洗 无菌滤纸吸干 (3) 配制适宜的培养基。
甚至进而从中分化、发育出整体植株的技术。
植物细胞的全能性（理论基础）
指具有完整细胞核的植物细胞，在一定条件下
能不断分裂和繁殖、发育成完整植株的潜在能力。
1. 植物组织培养的相关概念
脱分化
植物分化细胞进入细胞分裂周期，形成愈伤组织。
再分化 脱分化的组织或细胞在一定的条件下可分化为各种不 同组织的细胞类型。
无菌操作技术 组织培养 细胞培养 花药及花粉培养 离体胚培养 原生质体培养

植物组织培养应用

试管苗的快速繁殖 无病毒植物的培育 提取次生代谢产物 人工种子的培育 转基因植物的生产
植物组织培养的研究意义

运用组织培养方法可以在人为的条件下研究细胞、组 织或器官的繁殖、生长和分化，研究环境条件对植物 生长发育的影响。在工厂化育苗技术上，组织培养是 工厂化育苗的生产配方研究和无病毒种苗扩繁必须经 历的阶段；细胞培养技术在中草药方面的研究不仅可 以探索药用植物生理遗传和成分生物合成等一系列理 论问题，而且还可以为大规模细胞发酵生产药物提供 理论依据和技术参数；在转基因植物种苗的研究与开 发中，组织培养技术即是基本的研究手段，又是规模 开发的基本生产形式。
无菌操作技术
细胞工程的所有试验都要求再无菌条件下进 行，要求十分严格的无菌操作。 1、无菌室； 2、超净工作台； 3、生物材料的消毒； 4、试验器械、器皿和药品的灭菌。
无菌操作室的灭菌与消毒
缓冲间
无菌室
首次启用的无菌室一般可采用福尔马林熏蒸（5～
6m2无菌室用KMnO4 50g，倒入100ml甲醛（用搪瓷
培养基
培养基的成分 无机营养物，包括氮、磷、钾、钙、硫和镁 等大量元素以及一些微量元素如锰、锌、铜、 铁、硼 碳源，如糖类，2％~4%的蔗糖或葡萄糖是适 宜的碳源。 维生素，维生素B1(硫胺素)是必需的。
培养基
培养基的成分 生长调节剂(植物激素) 植物生长素，如IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚-3丁酸)、NAA(萘乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙 酸)、2,4,5-T(三氯苯氧乙酸)。 细胞分裂素，如BAP(苄氨基嘌呤)、6-BA(苄 基腺嘌呤)、2-ip(异戊烯氨基嘌呤)、激动素 (呋喃氨基嘌呤)。 有机附加物，一般是蛋白质水解物、酵母提取 物、麦芽提取物和椰汁。
细胞质工程 又称细胞拆合工程，是通过物理或化学方 法将细胞质与细胞核分开，再进行不同 细胞间核质重新组合，重新建成新细胞 细胞融合工程 是利用自然或人工的方法使两个或几个不 同细胞融合为一个细胞的过程
• 根据研究对象不同，细胞工程可分为
– 动物细胞工程 – 植物细胞工程 – 微生物细胞工程
2、细胞工程的发展
及除菌过滤器的清毒，高压蒸汽灭菌115℃ 20— 30分钟；
紫外线照射灭菌：多孔培养板的灭菌
－30分
钟 。
抽滤除菌：培养基等（培养基通过
0.22m过滤
装置－除菌）
细胞培养技术
细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无 菌条件的保存和生长。
1、取材和除菌；
2、配制培养基，对培养基进行灭菌；
3、接种、培养和传代。
悬浮细胞培养系统
悬浮细胞的来源：愈伤组织 需分散细胞，其方法：
用果胶酶打破细胞间的连接 增加生长激素的浓度，加快细胞分裂和生
外植体：茎尖或顶端分生组织
有时茎尖培养需要与热处理或化学处理方法结合， 才能起到有效的脱毒结果。
脱毒苗：利用组织培养获得的无病毒植株。
草莓
快速繁殖
植物组培苗快速繁殖的四个阶段 无菌苗的建立 组培苗的增殖 生根 移栽
百合
组培室
大花蕙兰
种质资源的保存

保存一个细胞就相当与保存一粒种子，但所占 的空间仅为原来的几万分之一，而且在-193度 的液氮中可以长时间保存，不像种子那样需要 年年更新或经常更新。
细胞工程的发展
植物细胞培养起源：20世纪初 20世纪30年代，植物细胞培养研究取得突破
1955年，激动素能促使培养细胞分裂
20世纪60年代，建立植物原生质体培养和融 合技术 20世纪70年代，外源基因能够植入植物细胞 体内 1983年，第一个转基因植物培育成功
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
20世纪90年代后，转基因植物进入产业化
“鲫金核质杂交鱼”
胚胎移植
也称受精卵移植，是指把优良种畜的早期胚胎从供体
母畜体内取出来，移到受体母畜的输卵管或子宫，
“借腹怀胎”繁殖后代的技术。
它是首先应用于繁殖家畜而发展起来的一种生物工程。
试管婴儿
克隆技术
克隆是指生物体通过细胞进行无性繁殖形成基 因型完全相同的后代个体，简称“无性繁殖”。
例：多莉、克隆猴 治疗性克隆
•多利
•克隆猴
277 次 乳 腺 细 胞 核移植实验； 获得29个发育为 8细胞的“胚”；
13头代孕母亲；
1996年7月5日， 羊羔6LL3，被命 名为“多莉”。
预想的克隆人技术路线
5. 细胞工程的应用
通过细胞培养物获得药物和其他有用的物质 如人参皂甙 通过植物细胞和组织培养获得快速繁殖的无性系植 物产品，包括良种苗木、名贵花卉、稀有资源等 如兰花 细胞融合产品 如 单克隆抗体、番茄薯“二层楼” 从细胞培养中筛选合乎希望的突变细胞株、再生突 变植株，可培育新品种 生殖工程上的应用 如借腹怀胎、试管婴儿
美梦终究没有成功!!番茄薯“二层 楼”
第二节
植物细胞工程
1. 植物组织培养
2. 植物细胞培养和次生代谢产物的生产
3. 单细胞分离技术
4. 植物体细胞杂交
5. 植物细胞原生质体制备与融合
6. 单倍体植物的诱发与利用 7. 人工种子
1. 植物组织培养
植物组织培养（概念） 是在无菌和人为控制外因（营养成分、光、温 度、湿度）条件下，研究、培养植物组织器官，
动物细胞工程 起源于疫苗的生产，1920-1950年，开发出 病毒或细菌疫苗 1951年开发能促使动物细胞体外培养技术 50年代以后开始大规模培养动物细胞生产 生物制品 70年代基因基因重组和杂交瘤技术的研究 1982年重组人胰岛素研究成功，标志着细 胞工程商业化的开始
细胞工程的发展前景
植物组织培养
物细胞以提取其天然产物。之后，用此方法生产
了哈尔碱、人参皂角苷、维斯纳精、紫杉醇等。
目前，最大批量工业化培养细胞(烟草细胞)已达
20吨。
我国，培养红豆杉细胞生产紫杉醇(抗肿瘤)
植物细胞培养系统
悬浮细胞培养系统 适于大量快速地增殖细胞，但不利于次生物质 的积累。 固定化细胞培养系统 细胞生长缓慢而次生物质含量高。
愈伤组织
植物组织表面形成的一团无序生长的薄壁细胞团。
外植体
能被诱发产生无性增殖系的器官或组织切段。
初代培养
最初建立的外植体的无菌培养阶段
继代培养
将已形成愈伤组织或已分化出根、茎、叶、花等的 培养物重新切割，转移到新的培养基上以进一步扩 大培养
试管苗
通过组织培养所获得的再生植株
植物细胞工程的基础技术
生根成芽阶段
诱导胚状体的形成。 胚状体：在组织培养中分化产生的具有芽端和根
端类似合子胚的构造。
该阶段需细胞分裂素和光照。
咖啡的愈伤组织
咖啡的胚状体
移栽成活阶段
适度的光、温、湿条件。 可在人工气候室中锻炼一段时间。
炼苗的原因


试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照 和温度，近100%的相对湿度环境条件下生长 从叶片上看，试管苗的角质层不发达，叶片通 常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛，甚至叶片 上出现了大量的水孔，而且，气孔的数量、大 小也往往超过普通苗
细胞融合技术
两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分 子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重 组的过程称为细胞融合。 细胞融合技术的主要过程： 1、制备原生质体； 2、诱导细胞融合； 3、筛选杂合细胞。
细胞核移植
细胞核移植：利用显微操作技术将一个细胞的细胞核
移植到另一个细胞中，或将两个细胞的细胞核(或细胞 质)进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一 项技术。 童鱼——世界上第一条没有父母的鱼
盘），冒浓烟，24hr，氨水中和至无甲醛味），经常 使用的无菌室在每次实验前必须开启紫外灯照射0.5至l 小时，然后避光0.5至l小时后方可进入操作
无菌室
上风口
下风口
缓冲间
培养器材的消毒
干热灭菌法：玻璃器皿、金属器具等的
消毒
方法，140～150℃，2～3小时 ；
湿热灭菌法：橡胶制品、无菌衣、帽和口罩以
获得单倍体植株、缩短育种年限

通过花药和花粉组织培养可以获得单倍体植物， 大大缩短了育种时间。使新品种的培育过程大 大简化
2. 植物细胞培养和次生代谢产物的生产
植物细胞培养的发展 植物细胞培养系统 植物细胞培养的应用
植物细胞培养的发展
1956年，Routier和Nickell提出工业化培养植
主要内容
第一节
第二节 第三节
概
述
植物细胞工程 动物细胞工程
第四节
微生物细胞工程(发酵工程)
第一节
1. 细胞工程概念
2. 细胞工程的发展
概
述
3. 细胞工程的基础知识
4. 细胞工程的相关技术
5. 细胞工程的应用
1. 细胞工程概念
细胞工程（cell engineering）：在细胞水平 上，采用类似工程设计的方法，运用精巧的 细胞学技术，有计划地改造遗传结构，从而 获得特定的细胞及产物的有关理论和技术方 法的学科。
离体的植物器官、组织或细胞
过程 脱分化
外植体
愈伤组织 再分化 根、芽
植物激素： 细胞分裂素、生长素
植物组织培养条件：
含有全部营养成分的 培养基、一定的温度、空 气、无菌环境、适合的PH、 适时光照等。
植物体
过程
植物细胞A 植物细胞B
植 物 细 胞 融 合
去细胞壁
酶解法
纤维素酶 果胶酶 离心 物理方法 振动 人工诱 电刺激 导方法 化学方法： 聚乙二醇
石斛组培苗 炼苗
组织培养的应用
脱毒
快速繁殖
快速繁衍珍稀濒危植物、名优特新品种和 脱毒苗。 植物种质资源的保存、挽救濒于灭绝的植 物
通过花药和花粉培养获得单倍体植株、缩 短育种年限
脱毒
原因：大多数农作物，特别是通过无性繁殖的植
物，受到一种或多种病毒的侵染，导致产量和品 质下降。
胞数量也增加许多。其中有些细胞在形态、结构和功 能上逐渐发生了差异，这种细胞之间差异的发生过程
就是细胞分化。个体发育的过程就是细胞分化的过程
，个体的各种器官和组织都是通过细胞分化形成的。
爪 证蟾 明的 细细 胞胞 核核 的移 全植 能实 性验 ，
4. 细胞工程的相关技术
无菌操作技术
细胞培养技术 细胞融合技术 细胞核移植 胚胎移植 染色体工程 克隆