动物医学 生化实验《实验四 SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS–PAGE)》课件
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实验四 SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS–PAGE）
【原理】
带电的颗粒（蛋白质）在电场的作 用下发生迁移，移动的速度决定于各蛋 白质的带电量和自身分子的大小。若使 各蛋白质成分的带电量相近似时，则各 蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋 白质成分自身分子的大小 。
SDS能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键， 使蛋白质变性成为松散的线状。同时大多数蛋白 质的每个氨基酸能与固定量的SDS相结合形成 SDS–蛋白质复合物。由于SDS解离后带有很强的 负电荷，致使SDS–蛋白质复合物都带上了相同密 度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有 的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质同原有的 电荷差异。SDS与蛋白质结合后，改变了蛋白质 原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似 椭圆柱形。
【 操 作】 （一）安装夹心式垂直板电泳槽 （二）配胶及凝胶板的制备 1．配胶： 分离胶（浓度为15％）
水 凝胶贮液
1.5 mol/L Tris-HCl pH8.8 10％SDS 10%过硫酸铵 TEMED 总计
4.6ml 10ml 5.0ml 0.2ml 0.2ml
8 uL 20ml
2．凝胶板的制备：用细长头滴管将胶混 合液加到两块玻璃板的缝隙内直至距离 短玻璃板上缘0.5cm处，插入梳形样品 槽模板 。大约30min胶聚合，继续放置 20~30min后 ，小心拔出梳形样品槽模 板 ，将凝胶板装入电泳槽中。
在电泳槽中倒入电极缓冲液，连接 电泳仪与电泳槽，上槽接负极，下槽接 正极。打开电源，待染料前沿迁移至距 硅橡胶框底边1~1.5cm处，停止电泳 。
Байду номын сангаас
（五）凝胶板剥离与固定
电泳结束后，取凝胶板，卸下硅橡胶 框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板 ， 将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液， 固定10min 。
SDS–蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁 移率，就不再受蛋白质原有电荷及其形状 的影响了，而只取决于椭圆柱长度，即蛋 白质分子的大小。聚丙烯酰胺凝胶电泳的 凝胶及电极缓冲体系中都含有SDS，所以 称为SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数呈直线关系：
lgMω = K1 – bm
Mω表示分子量，m表示迁移率，b表示斜率， K1表示常数。 15%的凝胶适用于分子量在 10 000~50 000范围的蛋白质；10%的凝 胶适用于分子量在10000 ～70 000范围的 蛋白质；5%的凝胶适用于分子量在25 000~2 000 000范围的蛋白质 。
【 试剂 】
1．标准蛋白质（Marker）。 2．连续体系SDS–PAGE有关试剂 ：样品
溶解液；30%丙烯酰胺；1%TEMED ； 10%过硫酸铵。 3．电极缓冲液 。 4．1%琼脂 。 5．固定液 。 6．染色液。 7．脱色液 。
【 器材 】 1．夹心式垂直板电泳槽。 2．电泳仪。 3．微量加样枪。 【材料】 纯化后的γ–球蛋白 。
（三）样品的处理与加样
1．样品的处理：向20ul 样品中加入等量 样品溶解液，溶解后，将其转移到 1.5ml离心管中，盖上盖子 ，在100℃ 沸水浴中保温5~10min，取出冷却后加 样。
2．加样：每个凹形样品槽内，只加一种 样品 。
（四）电泳
SDS连续系统预电泳采用120V， 60~ 120min。
（六）染色与脱色
将染色液倒入培养皿中，染色1h左右， 用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色， 直到蛋白质区带清晰，观察记录结果。
【原理】
带电的颗粒（蛋白质）在电场的作 用下发生迁移，移动的速度决定于各蛋 白质的带电量和自身分子的大小。若使 各蛋白质成分的带电量相近似时，则各 蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋 白质成分自身分子的大小 。
SDS能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键， 使蛋白质变性成为松散的线状。同时大多数蛋白 质的每个氨基酸能与固定量的SDS相结合形成 SDS–蛋白质复合物。由于SDS解离后带有很强的 负电荷，致使SDS–蛋白质复合物都带上了相同密 度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有 的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质同原有的 电荷差异。SDS与蛋白质结合后，改变了蛋白质 原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似 椭圆柱形。
【 操 作】 （一）安装夹心式垂直板电泳槽 （二）配胶及凝胶板的制备 1．配胶： 分离胶（浓度为15％）
水 凝胶贮液
1.5 mol/L Tris-HCl pH8.8 10％SDS 10%过硫酸铵 TEMED 总计
4.6ml 10ml 5.0ml 0.2ml 0.2ml
8 uL 20ml
2．凝胶板的制备：用细长头滴管将胶混 合液加到两块玻璃板的缝隙内直至距离 短玻璃板上缘0.5cm处，插入梳形样品 槽模板 。大约30min胶聚合，继续放置 20~30min后 ，小心拔出梳形样品槽模 板 ，将凝胶板装入电泳槽中。
在电泳槽中倒入电极缓冲液，连接 电泳仪与电泳槽，上槽接负极，下槽接 正极。打开电源，待染料前沿迁移至距 硅橡胶框底边1~1.5cm处，停止电泳 。
Байду номын сангаас
（五）凝胶板剥离与固定
电泳结束后，取凝胶板，卸下硅橡胶 框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板 ， 将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液， 固定10min 。
SDS–蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁 移率，就不再受蛋白质原有电荷及其形状 的影响了，而只取决于椭圆柱长度，即蛋 白质分子的大小。聚丙烯酰胺凝胶电泳的 凝胶及电极缓冲体系中都含有SDS，所以 称为SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数呈直线关系：
lgMω = K1 – bm
Mω表示分子量，m表示迁移率，b表示斜率， K1表示常数。 15%的凝胶适用于分子量在 10 000~50 000范围的蛋白质；10%的凝 胶适用于分子量在10000 ～70 000范围的 蛋白质；5%的凝胶适用于分子量在25 000~2 000 000范围的蛋白质 。
【 试剂 】
1．标准蛋白质（Marker）。 2．连续体系SDS–PAGE有关试剂 ：样品
溶解液；30%丙烯酰胺；1%TEMED ； 10%过硫酸铵。 3．电极缓冲液 。 4．1%琼脂 。 5．固定液 。 6．染色液。 7．脱色液 。
【 器材 】 1．夹心式垂直板电泳槽。 2．电泳仪。 3．微量加样枪。 【材料】 纯化后的γ–球蛋白 。
（三）样品的处理与加样
1．样品的处理：向20ul 样品中加入等量 样品溶解液，溶解后，将其转移到 1.5ml离心管中，盖上盖子 ，在100℃ 沸水浴中保温5~10min，取出冷却后加 样。
2．加样：每个凹形样品槽内，只加一种 样品 。
（四）电泳
SDS连续系统预电泳采用120V， 60~ 120min。
（六）染色与脱色
将染色液倒入培养皿中，染色1h左右， 用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色， 直到蛋白质区带清晰，观察记录结果。