高效液相色谱法测定金银花含片中绿原酸含量

高效液相色谱法测定金银花含片中绿原酸含量
摘要提供色谱柱为Spherigel C18色谱柱（200mm×4.6mm，5μm）、流动相为乙腈-1.0%醋酸水、检测波长327nm等色谱条件，建立了高效液相色谱法测定金银花含片中绿原酸含量的方法。

在该色谱条件下，绿原酸的含量在1.56~25μg/mL范围内线性关系良好，相关系数r=0.999 2，加样回收率为99.7%，RSD为2.63%（n=5），最低检出限为0.05μg/mL。

结果表明，该方法操作简单，分离度好，适用于金银花含片中绿原酸含量的测定。

关键词高效液相色谱法（HPLC）；绿原酸；金银花含片
金银花（Flos lonicerae）为忍冬科（Caprifoaceae）忍冬属（Lonicera）植物[1]。

金银花的活性成分之一为绿原酸（结构式见图1）。

绿原酸为咖啡酰奎尼酸衍生物，由奎尼酸和咖啡酸缩合而成，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等极性溶剂，微溶于乙酸乙酯，难溶于三氯甲烷、乙醚、苯等亲脂性溶剂，是一种重要的生理活性物质。

绿原酸为抗菌消炎的主要成分，对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、痢疾球菌、伤寒杆菌、肺炎球菌有显著的抑制作用；有抗病毒、升高白细胞、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基等作用；与人体血小板凝集和凝血因子的生成有关，还具有抗生育作用及对免疫系统的调节作用[2]。

本文采用高效液相色谱法，对金银花含片中绿原酸的含量进行测定，以期提高金银花含片质量标准可控性，为进一步完善其质量标准提供试验依据。

1仪器与试药
1.1仪器
DionexAT330（美国）高效液相色谱仪：由P680四元泵、UVD170U紫外检测器和AT330恒温箱组成；KQ 3200 B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司生产）。

1.2材料与试剂
金银花含片（河北省某厂生产）；绿原酸标准品（购自中国药品生物制品检定所）；甲醇、丙酮、无水乙醇、磷酸均为分析纯、乙腈为色谱纯，二次蒸馏水。

2方法与结果
2.1液相色谱条件
色谱条件：色谱柱为Spherigel C18色谱柱（200mm×4.6mm，5μm）（大连江申分离科学科技公司生产）；流动相：乙腈-1.0%醋酸水，梯度程序见表1。

检测波长327nm，进样量10μL，流速1mL/min。

2.2对照品溶液制备
精密称取置五氧化二磷减压干燥器中干燥10h以上的绿原酸对照品2.5mg，置50mL棕色容量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得（绿原酸含量50μg/mL）。

2.3供试品溶液的制备
用碾钵将金银花含片磨成细小粉末，精确取0.501 6g样品，置50mL棕色容量瓶中，加50％甲醇适量，超声提取30min使溶解，放冷至室温，加50％甲醇定容至刻度，摇匀、过滤即得。

2.4线性范围和检测限
分别取50μg/mL绿原酸标准品用甲醇配制成12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、1.56μg/mL的系列标准品，过0.45μm膜后，按2.1色谱条件每个浓度的标准品进样3次，记录峰面积。

以浓度为横坐标、峰面积平均值为纵坐标得到绿原酸的标准曲线方程为：y=985.22x-287.35，线性范围：1.56~25μg/mL，相关系数r=0.998 7。

将绿原酸标准溶液逐级稀释后，测得最低检测限为0.04μg/mL（S/N=3），最低定量限为0.2μg/mL（S/N=10）。

2.5精密度和回收率试验
取25μg/mL绿原酸标准溶液，按2.1色谱条件连续进样6次，每次进样10μL，以峰面积计算相对标准偏差，结果RSD为3.44%（n=6）。

取5份已知含量的金银花含片样品0.5g左右，精密称定，分别加入50μg/mL
标准品1.00mL，按样品处理的方法，以50%甲醇超声提取30min，过滤，过膜，按2.1色谱条件测定峰面积，计算加样回收率，得平均回收率为98.17%，RSD 为2.43%（n=5）。

2.6重复性试验
取金银花含片样品0.5g左右6份，精密称定，以50%甲醇超声提取30min，过滤，过膜，按2.1色谱条件测定峰面积，计算各组分绿原酸含量，结果RSD 为3.24%（n=6），表明重复性好。

2.7样品分析
取2.3制备的待测液过0.45μm膜后，按2.1色谱条件进样测定，平行进样5次，积分求峰面积。

根据回归方程，求得到绿原酸的平均含量为4.83mg/g。

2.8提取条件的选择
分别加入40%、50%、70%甲醇，50%、70%丙酮，40%、50%、70%乙醇，冷水和热水，分别定容至50mL，超声30min，过0.45μm膜，备用进样。

不同溶剂提取的绿原酸含量见表2。

可以看出，40%甲醇的提取效果最好，而绿原酸在水中的溶解度低，水提取的效率较低。

比较乙醇与甲醇提取效果，当乙醇浓度达到70 %时，提取率跟40 %甲醇接近。

考虑到甲醇的成本和毒性，试验可以选取70 %乙醇进行超声提取。

虽然绿原酸易溶于丙酮，70%丙酮和50%丙酮提取的样品含量与甲醇提取的样品结果相近，说明丙酮提取方法可行。

但由于丙酮的微毒性、直接进样丙酮的溶剂峰干扰较大，蒸干后再溶解进样操作复杂。

因此，不宜使用丙酮作为提取溶剂。

采用上述建立的分析方法，比较提取时间的影响，可以发现，30min提取比较完全，超声40min或45min，绿原酸的含量反而降低。

这是由于绿原酸稳定性差，超声时间过长，或超声温度过高，会引起绿原酸的分解。

所以，选取超声30min提取金银花含片中绿原酸的含量。

3结论
本文采用高效液相色谱，建立了金银花制剂中绿原酸含量的测定方法，该方法具有灵敏度高、抗干扰能力强、定量准确等特点；同时对提取溶剂的选择进行了研究，结果发现70%乙醇进行超声提取30min，与甲醇提取效果相当，可以节约测试成本。

4参考文献
[1] 谢碧秀，孙智达.金银花中主要有机酸的研究进展[J].现代食品科技，2007，23（9）：93-97.
[2] 崔晓燕，王素霞，候永利.金银花提取物的抗炎机制研究[J].中国药房，2007，18（24）：1861-1863.
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。

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