青蒿素类药物对结肠腺癌细胞LS174T的细胞毒作用

青蒿素类药物对结肠腺癌细胞LS174T的细胞毒作用目的考察青蒿素（ART）、双氢青蒿素（DHA）及蒿甲醚（AM）对结肠
腺癌细胞LS174T增殖的影响，为建立青蒿素类药物自身诱导代谢机制的体外研究体系奠定基础。

方法采用噻唑蓝（MTT）法检测不同浓度药物、分别作用不同时间后对细胞增殖的抑制情况，计算抑制率并求得半数抑制浓度（IC50）。

结果抑制率均随药物浓度的增大和时间的延长而增加，ART作用24、48、72 h对LS174T的IC50分别为> 240.00 μmol/L、> 240.00 μmol/L、211.18 μmol/L，DHA 对LS174T的IC50分别为91.46、80.45、45.60 μmol/L，AM对LS174T的IC50分别为> 320.00、262.90、163.93 μmol/L。

结论3种药物对LS174T增殖的抑制程度不同，但均呈浓度依赖性和时间依赖性。

标签：噻唑蓝；青蒿素；双氢青蒿素；蒿甲醚；LS174T
青蒿素（ART）是一种含独特内过氧桥结构的倍半萜内酯，由我国科学工作者从菊科植物黄花蒿中提取分离。

对其进行结构改造得到一系列衍生物，其中双氢青蒿素（DHA）是除ART外其他衍生物在体内的活性代谢产物[1]。

蒿甲醚（AM）是ART的醚类衍生物，其抗疟作用强于ART，不良反应轻微，且具有退热效应[2]。

ART类药物是目前唯一一类未产生明显耐药性的抗疟药，因而广泛用于疟疾特别是恶性疟疾的治疗，此外还有抗炎、抗肿瘤、抗心律失常、抗病毒、免疫抑制、抗血吸虫等药理作用[2-3]。

噻唑蓝（MTT）法是一种检测细胞存活和生长的方法，该法灵敏度高，重复性好，操作简便、经济、快速[4]。

本课题采用MTT法测定上述3种药物对结肠腺癌细胞LS174T增殖的影响，观察不同浓度药物以及作用不同时间的细胞毒作用。

实验结果将为后期从基因水平阐释ART类药物对CYP3A4和CYP2B6转录调节作用提供参考浓度，同时也为研究ART类药物抗癌活性提供依据。

1 材料与方法
1.1 试剂
人结肠腺癌细胞株LS174T（中科院上海细胞库），DMEM培养基（Thermo scientific），胎牛血清（北京元亨金马生物技术开发有限公司），100×青链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司），0.25%胰蛋白酶-乙二酸四乙胺（EDTA）消化液（北京索莱宝科技有限公司），MTT（sigma），二甲基亚砜（DMSO）（北京索莱宝科技有限公司），ART、DHA、AM标准品（中国食品药品检定研究院）。

1.2 仪器
MDF-U32V型超低温冰箱（SANYO），DK-98-ⅡA型电子恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），TDF-5-A型台式低速离心机（上海安亭科学仪器厂），311型CO2培养箱（Thermo scientific），SW-CJ-1F型生物净化工作台（苏州净
化设备厂），BDS200型倒置显微镜（重庆奥特光学仪器有限责任公司），TBS-108型往复式脱色摇床（海门其林贝尔仪器厂），BT25S型电子天平（德国Sartorius），Variskan Flash型全波长多功能酶标仪（Thermo Scientific）等。

1.3 细胞培养
采用含10%胎牛血清、100×青链霉素的DMEM高糖培养基，在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养。

细胞汇合度达到80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，传代。

1.4 细胞接种
取对数生长期细胞，用胰酶消化后制成单细胞悬液进行细胞计数，计数后调整细胞浓度至5×104个/mL。

取96孔培养板，预先设定空白孔（培养基），溶剂对照孔（细胞、溶剂、培养基），加药孔（药物、细胞、溶剂、培养基），均设3个复孔。

将细胞悬液接种于96孔板中央60个孔内，每孔200 μL，其余孔加磷酸盐缓冲液（PBS）。

将接种好的96孔培养板放入CO2培养箱中培养。

1.5 加药干预
将溶于DMSO的药物（1 000×）加入含10%胎牛血清的培养基中，使DMSO 浓度为0.1%。

细胞汇合度达80%时，取出，吸去旧培养基，加药孔分别加入不同浓度的含药培养基180 μL，对照孔中加入含0.1%DMSO培养基180 μL，继续培养24、48、72 h。

1.6 观察细胞形态
将96孔板置于倒置显微镜下，观察溶剂对照组和加药组细胞数量和形态变化并拍照记录。

1.7 呈色
24 h后，每孔加入新鮮配置的MTT溶液20 μL，放入培养箱中。

4 h后小心弃去孔内液体，并用滤纸吸干，每孔加入200 μL DMSO，在摇床上振摇10 min，使沉淀充分溶解。

1.8 测定OD值
用酶标仪测定490 nm处的OD值，并求均值。

1.9 计算抑制率和IC50
上述实验重复3次，用OriginPro7.5软件计算IC50。

1.10 统计学方法
采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

以P 0.1%对细胞生长有影响[6]。

因此，需要先用DMSO配成1000×储备液，再用含血清培养基稀释至所需浓度。

实验中240 μmol/L ART作用24、48 h和320 μmol/L AM作用24 h未达到IC50，但继续加大浓度药物会析出，使细胞与药物接触不均匀，影响结果准确性，因此未进行更高浓度的考察。

近来研究发现[7-8]，ART类药物可诱导细胞凋亡、影响细胞周期分布，因而具有抑制肿瘤细胞生长的作用。

体外实验也已证实对人乳腺癌细胞HTB27、白血病细胞K562[9]、肝癌HepG2[10]等有抑制作用。

本实验室后期实验要在LS174T细胞中研究ART类药物的自身诱导代谢机制，对药物干预浓度的选取就需要兼顾细胞毒作用，因为细胞毒作用可能掩盖诱导作用。

但青蒿素类药物是否影响结肠腺癌细胞LS174T的生长仍不明确。

本实验采用MTT法测定了3种ART 类药物对LS174T细胞的细胞毒作用，结果表明随着药物浓度和作用时间的增加，药物对细胞的抑制率也相应增加，呈明显的浓度依赖性和时间依赖性。

比较IC50发现，DHA抑制作用最强，AM次之，ART最弱。

结合倒置显微镜下观察，可见细胞数量减少及细胞碎裂、死亡等形态学变化。

说明ART类药物对LS174T 也有抑制作用，但比较其他细胞系，对LS174T的抑制浓度偏高。

因此，后续实验设定药物干预浓度时，可选择的浓度范围较广。

DHA对LS174T 的抑制作用较强，且不良反应轻微，可为临床治疗结肠腺癌提供依据。

[参考文献]
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