卵母细胞及其胚胎发育潜能相关的生物标记物

卵母细胞及其胚胎发育潜能相关的生物标记物
邵丽;崔毓桂
【摘要】卵母细胞发育潜能是在卵泡发育过程中逐步获得的,卵丘细胞(CCs)与卵母细胞紧密接触,卵泡液(FF)为卵母细胞提供良好的微环境.因此,CCs功能及FF成分组成可以反映卵母细胞的发育潜能.CCs为卵母细胞提供代谢所需的营养物质如丙酮酸、丙氨酸、胆固醇等,并在卵母细胞的成熟、排卵、受精过程中发挥重要的作用.FF作为卵巢体壁细胞与血浆之间的媒介,其内的代谢相关分子、激素类分子、活性氧分子及一些细胞因子与卵母细胞的成熟及发育潜能密切相关.综述与卵母细胞及其胚胎发育潜能相关的生物标记物,主要是CCs、FF中的相关因子,两者结合为胚胎学家选择最佳的卵子提供参考.
【期刊名称】《国际生殖健康/计划生育杂志》
【年(卷),期】2014(033)005
【总页数】6页(P379-383,395)
【关键词】卵母细胞;生物学标记;卵丘细胞;卵泡液;胚胎发育
【作者】邵丽;崔毓桂
【作者单位】210029 南京医科大学第一附属医院生殖医学中心;210029 南京医科大学第一附属医院生殖医学中心
【正文语种】中文
欧洲人类生殖医学和胚胎学会（ESHRE）第13次调查统计显示，欧洲2009年体外受精（IVF）临床妊娠率为32.9%［1］。

为了提高临床妊娠率，临床上常在一
个周期植入多个胚胎，使多胎妊娠率高，后者则可引起流产、难产、产后出血、胎儿生长受限等并发症增多。

单胚胎移植（singleembryo transfer，SET）可以有效地降低多胎妊娠率，SET达到满意临床妊娠率的关键是获得优质胚胎。

目前评价卵母细胞和胚胎质量主要依赖于相应的形态学参数，如卵子直径、卵丘扩张程度、胚叶个数及胚胎碎片率等，然而这些形态学检查方法缺乏客观性及准确性［2］。

因此，缺乏准确、敏感的评价卵子及其胚胎质量的方法，是SET尚未被临床广泛接受的原因之一。

因而，植入前通过无创性手段预测卵母细胞的发育潜能以获得优质卵子及其高质量的胚胎，是胚胎学家面临的挑战。

所谓卵母细胞的发育潜能应包括：①能够完成第一次减数分裂恢复。

②受精后能正常卵裂。

③受精后能发育至囊胚期。

④能够足月活产。

⑤子代健康［3］。

这些发育潜能是在卵母细胞成熟过程中逐步获得的。

从卵母细胞成熟角度来说，发育潜能包含卵母细胞的核成熟和细胞质成熟，只有胞质和胞核同步成熟才能完成卵母细胞的成熟，并完成受精及后续的胚胎发育，因为在早期胚胎发育过程中母源性基因的表达起主要作用［4］。

近年有大量研究预测卵母细胞发育潜能的因子，可望应用于临床辅助生殖技术（ART）。

本文就卵母细胞及其胚胎发育潜能的相关生物标记物进行综述。

在卵泡发育过程中，颗粒细胞分化为两类不同的表型：①壁颗粒细胞（mural granulose cells，MGCs），位于卵泡腔周围。

②CCs，紧紧围绕在卵母细胞的周围。

前者对雌二醇（E2）合成和卵泡破裂是必要的，后者与卵母细胞发育密切相关。

CCs和卵母细胞之间存在双向交流，对两者的发育及功能都很重要，这种交流依赖于旁分泌及缝隙连接两种方式。

CCs为卵母细胞提供发育所必需的营养物质，促进卵母细胞发育成熟、排卵，甚至作用延及受精过程［5］。

反过来，卵母细胞可调控CCs的细胞外基质的合成、细胞分化、代谢活性及类固醇激素的合成［6］。

CCs具有特异性（单个卵子对应单群CCs）和非侵入性的特点。

基于以上
特征，CCs特征性基因表达谱可以间接反映卵子的发育潜能，可能作为预测卵子
质量的生物标记物。

随着分子生物学技术的发展，包括早期的单纯逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、近年的
基因芯片联合RT-PCR、蛋白质芯片等，通过CCs生物标记物预测卵子发育潜能
的相关研究得以深入。

1.1 单纯RT-PCR技术McKenzie等［7］按照胚胎等级分组，运用RT-PCR技术研究人卵母细胞特异性因子生长分化因子9（growth differentiation factor9，GDF9）的下游靶基因透明质酸合成酶2（hyaluronic acid synthase 2，HAS2）、环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）和骨形态发生蛋白内源性拮抗剂（gremlin1，GREM1）在CCs上的表达，发现三者在高分级胚胎中表达量明显
升高，尤其GREM1。

另一项研究也得出了相似的结论，认为GREM1是与胚胎发育正相关的生物标记物［8］。

这两项研究均发现，穿透素3（pentraxin 3，
PTX3）与卵丘扩张相关，但与胚胎发育潜能不相关。

另一研究对75例患者的
674个卵子所对应的CCs行RT-PCR后证实，GREM1与卵子成熟、受精及受精
后的胚胎发育呈正相关，同时也发现脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）与卵母细胞质量呈负相关［9］。

此外，有研究表明，人CCs上的多功能蛋白聚糖（versican，VCAN）和COX2与妊娠结局相关，且血管细胞黏附分子（VCAM）、GREM1、磷酸果糖激酶（PFKP）与婴儿出生体质量呈正相关［10］。

1.2 基因芯片联合RT-PCR技术有学者应用高通量技术如基因芯片，结合功能基因组学，研究CCs上转录组学特征。

Ouandaogo等［11］确定了人CCs上某些与卵母细胞成熟相关的基因，且发现与体内成熟卵子相比，体外成熟（IVM）卵子的CCs上与卵丘扩张及卵母细胞成熟相关的基因表皮调节素（EREG）、双调蛋白（AREG）、PTX3是下调的，同时与细胞周期相关的基因及与DNA复制、修复、
联会相关的基因都是上调的。

进一步地，Assidi等［12］运用两种基因芯片平台（custom-made和OneArray）筛选出了人CCs上6个与妊娠结局正相关的生
物标记物，包括二肽基肽酶8（dipeptidylpeptidase 8，DPP8）、组蛋白集群（histone cluster 1 H4c，HIST1H4C）、泛醌蛋白1（ubiquilin 1，UBQLN1）、钙调蛋白1（calmodulin 1，CALM1）、神经纤毛蛋白1（neuropilin 1，NRP1）和蛋白酶体26S亚单位非ATP酶6［proteasome（prosome，macropain）26 Ssubunitnon-ATPase 6，PSMD6］以及1个负相关的生物标记物转录因子
myb1靶点（targetof myb1，TOM 1）。

TOM1的功能主要和蛋白酶体相关，
参与调节泛素化和细胞内物质转运、抑制炎症样因子通路及增强子结合蛋白（AP），因此推测TOM1可能抑制了排卵过程。

卵母细胞成熟过程中，黄体生成激素（LH）峰起关键作用。

最近一项研究比较到
达LH峰之前2 h及LH峰之后6 h的两个时间点牛CCs上基因表达谱变化，发现LH峰后CCs上与细胞生长和增殖相关的基因：血小板反应蛋白1（thrombospondin1，THBS1）、EREG、泛素结合酶E2N（ubiquitin-conjugating enzyme E2N，UBE2N）、肿瘤坏死因子α诱导蛋白6（tumornecrosis factorα-induced protein 6，TNFAIP6）的表达上调，而与蛋白合成及细胞运动相关的基因：毛球族同族体2（tribbles homolog 2，TRIB2）、ERBB受体反馈抑制剂（ERBB receptor feedback inhibitor，ERRFI1）表达下调［2］。

这一研究增加了对卵母细胞成熟最后阶段的相关生物学事件的认识。

另一项研究比较了LH峰前后牛CCs的基因表达谱变化，同时按照胚胎是否发育成囊
胚分成2组，结果提示，在LH峰之后，2组未得出差异表达的基因；在LH峰之前，筛选出与胚胎发育潜能正相关的转录产物：凋亡染色质缩合诱导物1（apoptotic chromatin condensation inducer1，ACIN1）、抑制素βA （inhibin beta A，INHβA）、丝甘蛋白聚糖（serglycin，SRGN）、TRIB2、类
固醇甲基氧化酶1（sterol-C4-methyloxidase，MSMO1）及负相关因子TNFAIP6［13］。

故研究者认为，卵子发育潜能的差异是客观存在的，LH峰掩盖了这种差异，因此研究CCs上与卵子发育潜能相关的因子应当是在LH峰之前。

最近一项新研究，按照卵子核染色质呈环状围绕核仁（SN）和核染色质弥散围绕
核仁（NSN），将小鼠CCs分成CCs-SN及CCs-NSN两组，CCs-SN组卵子发
育潜能高，CCs-NSN组卵子发育潜能低，应用基因芯片技术筛选出4个与卵子发育潜能正相关的生物标记物：HAS2、PTX3、TNFAIP6、前列腺素内源性合成酶
2（PTGS2），这些基因与卵丘扩张及稳定相关；一个负相关的生物标记物：抗苗勒管激素（AMH）［14］。

Feuerstein等［15］在2012年的一项研究中同样也应用了基因芯片技术，按照IVF过程中胚胎是否发育成囊胚分组，在人CCs上筛
选出3个与胚胎发育潜能正相关的生物标记物，分别为脂滴包被蛋白2（perilipin，PLIN2）、G蛋白信号调节因子（regulatorof G-protein signaling2，RGS2）和血管生成素（angiogenin，ANG），在排除了实验条件和患者之间的差异后，确定了RGS2为最有意义的生物标记物。

高通量芯片技术作为一种研究工具，筛选出了很多有意义的生物标记物，对于这些生物标记物是否真正具有预测效能，还需要进一步的功能研究。

一项通过基因芯片技术研究牛卵母细胞发育潜能相关因子，筛选出CCs上4种金属蛋白酶作为负性
生物标记物，分别为组织蛋白酶（cathepsins）B，S，Z和K；应用上述因子的
抑制剂后，发现对卵母细胞发育产生了逆转效应，从而确定了其中的cathepsins B，S和Z为负性生物标记物，且通过凋亡途径介导了卵子发育潜能的降低［16］。

1.3 蛋白质芯片技术蛋白质翻译是一个复杂的高速反应过程，mRNAs不稳定，且
与其相应的蛋白质降解/合成速率存在差异以及蛋白质合成过程中翻译后修饰，因
此mRNAs与相应蛋白质的表达水平并不一定平行。

将蛋白和mRNA联合检测，将提高卵子质量相关生物标记物的预测效能。

最新一项研究运用反向蛋白芯片分析
技术（reverse phase protein array，RPPA）对4例患者的13个卵丘卵母细胞
复合体（cumulusoocyte complex，COCs）的CCs进行了独立样本分析，所取CCs均来自未成熟卵子以及IVF失败卵子，以黏着斑蛋白（vinculin，VCL）为内参蛋白，得出病毒致癌基因同源物（viral oncogene homolog，SRC）和胞外信号调节激酶2（extracellular signal regulated kinase，ERK2）两种潜在的生物
标记物［17］。

这一研究建立了低质量卵子对应的CCs的蛋白表达库，筛选出两
个具有潜在临床诊疗意义的因子。

虽然有关CCs上的生物标记的研究很多，但是所获得的生物标记物的重复性很差，可能的原因是缺乏共同的评价标准评价卵子发育潜能和胚胎的发育水平；所运用的芯片检测平台不同；以及取样不同（单群CCs还是混合CCs）。

因此，那些已发
表的CCs上的预测卵子发育潜能的众多因子，其真正的预测效能如何，需要进行
更多的检验和深入的功能研究。

FF是卵母细胞发育的微环境，其由血浆通过“血-卵泡屏障”超滤和颗粒细胞及膜细胞分泌活动共同形成。

因此，FF中许多生物分子被认为可以反映卵子代谢和发
育的状态。

研究发现，在牛FF的外泌体和内泌体中均存在微小RNA（miRNAs），经过功能分析和信号通路（pathway）分析，这些miRNAs主要参与调节卵泡发
育及卵子生长［18］。

因而，FF与卵母细胞的发育潜能是密切相关的。

FF成分复杂，有卵母细胞和其他卵泡细胞的代谢底物及产物，还有复杂的生物因子，包括代谢相关分子、激素类分子、活性氧（ROS）因子和细胞因子等。

2.1 FF中的代谢相关分子FF中包含一系列代谢分子，卵母细胞因此积聚营养物质，满足生长发育。

这些代谢分子包括三大代谢的中间物（即葡萄糖、氨基酸、脂肪酸）、一些代谢激素及代谢相关的小分子有机物等。

FF中的葡萄糖是卵子能量代
谢的重要物质。

Bertoldo等［19］采用磁共振氢谱（1H-NMR）研究猪FF中代
谢分子与卵泡直径和季节的关系，发现大卵泡FF中葡萄糖含量比小卵泡FF中多，
大卵泡囊胚形成率较高，推测FF中高葡萄糖浓度与卵子发育潜能呈正相关。

Wallace等［20］按照IVF受精后胚胎有无卵裂分组，运用1H-NMR分析人FF
中的代谢分子，发现FF中高葡萄糖、高密度脂蛋白（HDL）含量与低卵母细胞囊胚形成率相关。

对于FF中葡萄糖浓度与卵子发育潜能的关系虽然尚未明确，但可以肯定的是，FF中葡萄糖浓度随着卵泡直径及生长时期而变化，并与卵子的发育
潜能相关。

脂质分子是类固醇激素合成的原料，也在FF中聚集，其种类和含量的变化影响卵子的发育潜能。

有研究运用气相色谱-质谱联用法，确定了牛FF中共有37种脂肪酸，其中饱和脂肪酸对卵子有伤害［21］。

FF中的非必需脂肪酸（nonesterified fatty acids，NEFA）也被广泛研究，Jungheim等［22］发现了人FF中高浓度
的NEFA与COCs的不良形态学相关。

另一项研究在小鼠植入前胚胎培养过程中
提高软脂酸的浓度而导致胎儿生长受限和低出生体质量儿［23］，因而认为NEFA是卵子质量的负相关因子。

FF中几乎所有的必需氨基酸和大部分非必需氨
基酸浓度均低于血清，但FF中谷氨酸浓度较血清高3倍，并发现谷氨酰胺转化为谷氨酸及氨的反应对卵母细胞完成减数分裂起重要作用［24］。

对FF中相关代谢激素浓度与临床IVF结局关系的研究发现，获卵数与抵抗素正相关，与胰岛素、脂联素负相关，同时抵抗素与IVF后胚胎存活数呈显著正相关，
瘦素与IVF后胚胎存活数负相关［25］。

提示FF中抵抗素是IVF结局的正相关因子，而瘦素、胰岛素和脂联素可能是IVF结局的负相关因子。

另有研究指出，维
生素A作为人体代谢所必需的微量元素，其活性形式全反式视黄酸（ATRA），在优质胚胎对应的FF中含量高，而在子宫内膜异位症患者的FF中显著降低［26］。

2.2 FF中的激素FF中激素在卵母细胞成熟及后续的胚胎发育潜能中发挥极其重要的作用，包括直接作用和间接作用：①直接作用，指类固醇激素与卵子内的核类固醇受体结合，作为转录因子进入卵子胞核内发挥作用。

②间接作用，激素作用于颗
粒细胞和膜细胞，由这些细胞分泌一些细胞因子，参与卵子的发育及成熟。

目前在FF中发现的激素，包括卵泡刺激素（FSH）、LH、人绒毛膜促性腺激素（hCG）、E2、孕激素（P），并认为高浓度的E2、FSH、hCG、LH促进卵子成熟，与成功受精相关［27］；E2还通过引起卵细胞膜上钙离子内流形成特殊的钙振荡，从而促进卵母细胞胞质成熟［28］。

然而，最近也有研究发现，牛体内成熟卵子的FF 中，低E2、高孕激素浓度与卵子高发育潜能相关［29］。

因此，FF中雌、孕激素确切的作用有待进一步研究。

2.3 FF中的ROS与抗氧化系统ROS是一类含有不成对电子的含氧分子，包括超
氧阴离子、过氧化氢（H2O2）、羟自由基等。

FF中ROS相关产物包括H2O2、脂质过氧化物（LPO）及其降解产物丙二醛（MDA）和壬烯醛（HNE）等；FF中抗氧化物包括：①酶促类，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽
过氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）。

②
非酶促类，如褪黑素、维生素E等［30-31］。

近年FF中ROS及抗氧化水平与卵子及胚胎质量的关系成为研究热点。

分析人FF、血浆及尿中的氧化、抗氧化因子与IVF患者临床结局的关系，发现FF中氧化水平与卵巢对FSH的刺激反应性呈正相关，且子宫内膜异位症患者FF中抗氧化能力减弱［32］。

由此推测，FF高氧化水平是卵子发育的负相关因素，且FF高氧化水
平者发生卵巢过度刺激综合征（OHSS）的风险增加。

另一项研究分析牛体内成熟卵子FF中H2O2和LPO与卵泡闭锁、卵泡直径、优势卵泡的关系，发现在优势
卵泡及非闭锁卵泡的FF中H2O2浓度较次级卵泡及闭锁卵泡高，提示FF中ROS 活性与卵泡形成过程相关［31］。

Fujimoto等［30］发现，人FF中LPO及相关抗氧化物酶活性与胚胎的质量无关。

虽然FF中ROS对卵泡形成及卵子发育过程
中的作用尚存在争议，但是FF中ROS与抗氧化物之间的平衡对卵子发育潜能至
关重要，氧化应激及过度抗氧化状态均对卵子产生有害影响。

2.4 FF中的细胞因子FF是介乎血浆和卵泡细胞之间物质交换的一种体液，内含多种细胞因子。

许多研究致力于探讨FF中细胞因子与卵母细胞发育潜能的关系，以期能找到FF中预测卵母细胞质量的细胞因子。

Ledee等［33］检测139份人FF，发现FF中粒细胞集落刺激因子（G-CSF）与卵子发育潜能正相关。

也有研究发现，在因输卵管因素行IVF患者的FF中，白细胞介素18（IL-18）及IL-18结合蛋白（IL18-BP）与卵子成熟率、囊胚形成率及临床妊娠率之间无相关关系［34］。

另一项研究发现，人FF中高水平的可溶性人类白细胞抗原G（sHLA-G）是卵子受
精能力的负性预测因子，但与胚胎质量不相关［35］。

应用蛋白质组学技术确定了FF中许多蛋白质及其功能。

最近，Ambekar等［36］收集因男方原因行IVF者的FF，运用液相色谱分析法确定了480个蛋白质，其中的320个未见报道，大部分定位于细胞外，生物学功能涉及酶催化、分子转运活
性及细胞外基质合成等。

另一项研究将FF按卵子受精与否分组，运用液相色谱法对来自12例患者的24个卵子所对应的FF进行蛋白质组学研究，确定了53个差异蛋白，挑选出硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）进行验证，提出HSPG可作为预测卵子受精的正性生物标记物［37］。

在IVM过程中，未成熟卵子在培养液中经过体外培养而成熟，这一过程模拟了卵
子体内成熟的过程，因而培养液理论上对应于FF。

因此，很多研究围绕FF中与卵子发育潜能相关的生物活性因子，并试图改进IVM培养液，以期IVM后获得优质卵子。

关于预测卵母细胞发育潜能相关生物标记物的研究很多，各有优缺点。

结合功能基因组学，应用高通量技术筛选出了一系列CCs上及FF中的生物标记物，但缺少功能研究和预测效能的大样本研究。

FF可能混有外周血浆，且成分复杂，又需经阴
道穿刺取卵而降低了患者的依从性，且受年龄、吸烟、促排卵方案等因素的影响较大，因此FF中生物标记物的临床应用有一定的局限性。

若将CCs与FF两者结合
起来，则可能为胚胎学医生选择优质卵母细胞提供有价值的参考。

【相关文献】
［1］Ferraretti AP，Goossens V，Kupka M，et al.Assisted reproductive technology in Europe，2009：results generated from European registersby ESHRE［J］.Hum Reprod，2013，28（9）：2318-2331.
［2］Assidi M，Dieleman SJ，Sirard MA.Cumulus cell gene expression following the LH surge in bovine preovulatory follicles：potential early markers of oocyte competence ［J］.Reproduction，2010，140（6）：835-852.
［3］Sirard MA，Richard F，Blondin P，etal.Contribution of the oocyte toembryo quality ［J］.Theriogenology，2006，65（1）：126-136.
［4］Li L，Zheng P，Dean J.Maternal controlofearlymouse development
［J］.Development，2010，137（6）：859-870.
［5］Tanghe S，Van Soom A，Nauwynck H，etal.Minireview：Functions of the cumulus oophorus during oocyte maturation，ovulation，and fertilization［J］.MolReprod Dev，2002，61（3）：414-424.
［6］Sugiura K，Pendola FL，Eppig JJ.Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells：energymetabolism［J］.Dev Biol，2005，279（1）：20-30.
［7］McKenzie LJ，Pangas SA，Carson SA，et al.Human cumulus granulosa cell gene expression：a predictor of fertilization and embryo selection in women undergoing IVF ［J］.Hum Reprod，2004，19（12）：2869-2874.
［8］Cillo F，Brevini TA，Antonini S，etal.Association between human oocyte developmental competence and expression levels of some cumulusgenes
［J］.Reproduction，2007，134（5）：645-650.
［9］Anderson RA，SciorioR，KinnellH，etal.Cumulusgene expression as a predictor of human oocyte fertilisation，embryo development and competence to establish a pregnancy［J］.Reproduction，2009，138（4）：629-637.
［10］Gebhardt KM，Feil DK，Dunning KR，et al.Human cumulus cell gene expression as a biomarker of pregnancy outcome after single embryo transfer［J］.Fertil Steril，2011，96（1）：47-52 e42.
［11］Ouandaogo ZG，Frydman N，Hesters L，et al.Differences in transcriptomic profiles of human cumulus cells isolated from oocytesatGV，MⅠand MⅡstagesafter in vivoand in vitro oocyte maturation［J］.Hum Reprod，2012，27（8）：2438-2447.
［12］Assidi M，Montag M，Van der Ven K，etal.Biomarkers of human oocyte
developmental competence expressed in cumulus cells before ICSI：a preliminary study ［J］.JAssistReprod Genet，2011，28（2）：173-188.
［13］Gilbert I，Robert C，Vigneault C，et al.Impact of the LH surge on granulosa cell transcript levelsasmarkers of oocyte developmental competence in cattle
［J］.Reproduction，2012，143（6）：735-747.
［14］Vigone G，Merico V，Prigione A，et al.Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of theirenclosed antraloocytes［J］.BMC Genomics，2013，14：380.
［15］Feuerstein P，Puard V，Chevalier C，et al.Genomic assessment of human cumulus cell marker genes as predictors of oocyte developmental competence：impact of various experimental factors［J］.PLoSOne，2012，7（7）：e40449.
［16］Bettegowda A，Patel OV，Lee KB，et al.Identification of novel bovine cumulus cell molecular markers predictive of oocyte competence：functional and diagnostic implications［J］.Biol Reprod，2008，79（2）：301-309.
［17］Puard V，Tranchant T，Cadoret V，et al.Semi-quantitative measurement of specific proteins in human cumulus cells using reverse phase protein array［J］.Reprod Biol Endocrinol，2013，11（1）：100.
［18］Sohel MM，Hoelker M，Noferesti SS，et al.Exosomal and Non-Exosomal Transport of Extra-Cellular microRNAs in Follicular Fluid：Implications for Bovine Oocyte Developmental Competence［J］.PLoSOne，2013，8（11）：e78505.
［19］BertoldoMJ，Nadal-Desbarats L，Gerard N，etal.Differences in the metabolomic signatures of porcine follicular fluid collected from environments associated with good and poor oocyte quality［J］. Reproduction，2013，146（3）：221-231.
［20］Wallace M，Cottell E，Gibney MJ，et al.An investigation into the relationship between themetabolic profile of follicular fluid，oocyte developmental potential，and implantation outcome［J］.Fertil Steril，2012，97（5）：1078-1084.e1-e8.
［21］Bender K，Walsh S，Evans AC，et al.Metabolite concentrations in follicular fluid may explain differences in fertility between heifers and lactating cows［J］.Reproduction，2010，139（6）：1047-1055.
［22］Jungheim ES，Macones GA，Odem RR，etal.Associationsbetween free fatty acids，cumulus oocyte complex morphology and ovarian function during in vitro fertilization ［J］.Fertil Steril，2011，95（6）：1970-1974.
［23］Jungheim ES，Louden ED，ChiMM，etal.Preimplantation exposure ofmouse embryos to palmitic acid results in fetalgrow th restriction followed by catch-up growth in the offspring［J］.Biol Reprod，2011，85（4）：678-683.
［24］Jozwik M，Jozwik M，Teng C，etal.Amino acid，ammonia and urea concentrations in human pre-ovulatory ovarian follicular fluid［J］. Hum Reprod，2006，21（11）：
2776-2782.
［25］Varnagy A，Bodis J，Kovacs GL，et al.Metabolic hormones in follicular fluid in women undergoing in vitro fertilization［J］.J Reprod Med，2013，58（7/8）：305-311. ［26］Pauli SA，Session DR，Shang W，et al.Analysis of follicular fluid retinoids in women undergoing in vitro fertilization：retinoic acid influences embryo quality and is reduced in women with endometriosis［J］.Reprod Sci，2013，20（9）：1116-1124. ［27］Revelli A，Delle Piane L，Casano S，et al.Follicular fluid content and oocyte quality：from single biochemical markers to metabolomics［J］.Reprod Biol Endocrinol，2009，7：40.
［28］Tesarik J，Mendoza C.Direct non-genomic effects of follicular steroids on maturing human oocytes：oestrogen versus androgen antagonism［J］.Hum Reprod Update，1997，3（2）：95-100.
［29］Aardema H，Roelen BA，van Tol HT，et al.Follicular 17betaestradiol and progesterone concentrations and degree of cumulus cellexpansionaspredictorsof in vivo-matured oocyte developmental competence in superstimulated heifers
［J］.Theriogenology，2013，80（6）：576-583.
［30］Fujimoto VY，Bloom MS，Huddleston HG，et al.Correlations of follicular fluid oxidative stress biomarkers and enzyme activities with embryomorphology parameters during in vitro fertilization［J］. FertilSteril，2011，96（6）：1357-1361.
［31］Hennet ML，Yu HY，Combelles CM.Follicular fluid hydrogen peroxide and lipid hydroperoxide in bovine antral follicles of various size，atresia，and dominance status ［J］.J Assist Reprod Genet，2013，30（3）：333-340.
［32］Velthut A，Zilmer M，Zilmer K，et al.Elevated blood plasma antioxidant status is favourable for achieving IVF/ICSIpregnancy［J］.Reprod Biomed Online，2013，26（4）：345-352.
［33］Ledee N，Munaut C，Serazin V，et al.Performance evaluation of microbead and ELISA assays for follicular G-CSF：a non-invasive biomarker of oocyte developmental competence for embryo implantation［J］.JReprod Immunol，2010，86（2）：126-132. ［34］Radwan P，Radwan M，Polac I，et al.IL-18 and IL-18 binding protein concentration in ovarian follicular fluid of women with "tubal factor"subjected to in vitro fertilization［J］.Postepy HigMed Dosw（Online），2013，67：463-470.
［35］Jee BC，Suh CS，Kim SH，etal.Soluble human leukocyte antigen G level in fluid from single dominant follicle and the association with oocyte competence
［J］.YonseiMed J，2011，52（6）：967-971.
［36］Ambekar AS，NirujogiRS，Srikanth SM，etal.Proteomic analysisof human follicular fluid：a new perspective towards understanding folliculogenesis［J］.JProteomics，2013，87：68-77.
［37］Bayasula，Iwase A，Kobayashi H，et al.A proteomic analysis of human follicular fluid：comparison between fertilized oocytes and non-fertilized oocytes in the same patient［J］.J Assist Reprod Genet，2013，30（9）：1231-1238.。