notch1信号通路相关基因mrna表达乳腺癌变、进展相关性应用研究

分类号：密级：
学号：2012109037 单位代码：10759
石河子大学
硕士学位论文
Notch1信号通路相关基因mRNA表达与乳腺
癌变、进展相关性研究
学位申请人李文琴
指导教师曹玉文
李锋
申请学位门类级别医学硕士
学科、专业名称病理学与病理生理学
研究方向肿瘤病理学
所在学院医学院
中国·新疆·石河子
2015 年6 月
Correlation between mRNA expression of genes related in Notch1 pathway and the initiation and progression of breast cancer
A Dissertation Submitted to
Shihezi University
In Partial Fulfillment of the Requirements
for the Degree of
Master of Medicine
By
Li Wen Qin
(Pathology and pathophysiology)
Supervisor: Cao Yu Wen
Li Feng
June, 2015
摘要
目的：研究癌旁正常乳腺组织(ANBT)、乳腺非典型导管增生(ADH)、导管原位癌(DCIS)、浸润性导管癌(IDC)中Notch1信号通路基因Notch1、N1IC和Snail 的mRNA表达状况和临床病理特征相关性，初步探讨Notch1信号通路分子在乳腺癌变、进展中的作用。

方法：运用实时荧光定量PCR（real-time qRT-PCR）方法检测80例IDC、20例DCIS、15例ADH及25例ANBT中Notch1、N1IC和Snail mRNA表达，比较三者在四种不同乳腺组织中的mRNA差异性表达，并结合课题组其蛋白表达的状况，进一步分析浸润癌中Notch1、N1IC和Snail mRNA表达与临床病理特征的相关性及三者表达的相关性。

结果：(1) Notch1 mRNA表达分别在ANBT（0.55±0.26）、ADH（0.81±0.34）、DCIS （1.79±0.62）和IDC（2.42±0.99）组中逐渐升高，并且IDC和DCIS组分别与ANBT 组比较，其表达有显著统计学差异（P=0.000，P=0.000）；Notch1 mRNA表达与浸润癌组织学高分级（P=0.000）、淋巴结转移（P=0.000）和TNM高分期（P=0.02）正相关；Notch1 mRNA与蛋白表达（前期结果）呈显著正相关（r=0.404，P=0.000）；(2)N1IC mRNA 在上述四组乳腺组织中的表达趋势（ANBT：0.70±0.32，ADH：1.05±0.44，DCIS：2.09±0.75，IDC：2.19±0.97）与Notch1表达一致，也呈升高趋势，并且IDC、DCIS组分别与ANBT组比较，其表达有显著统计学差异（P=0.000，P=0.000），并与高分级（P=0.000）、淋巴结转移（P=0.000）和TNM高分期（P=0.03）正相关，也与蛋白表达呈显著正相关（r=0.332，P=0.003）；(3)Snail mRNA在乳腺组织中的表达也呈升高趋势（ANBT：0.55±0.36，ADH：1.06±0.43，DCIS：2.18±0.77，IDC：2.51±0.98），并且IDC、DCIS和ADH组分别与ANBT组比较，表达有显著统计学差异（P=0.000，P=0.000，P=0.001），并与淋巴结转移（P=0.001）和TNM高分期（P=0.000）正相关，同时与蛋白表达呈正相关，但无统计学显著性（r=0.217，P=0.054）。

(4) Notch1信号通路中Notch1、N1IC和Snail三个基因mRNA表达进行两两比较，在四组乳腺组织中均呈显著正相关（ADH组中无统计学显著性）。

结论：(1) Notch1、N1IC和Snail mRNA表达在乳腺癌变过程中逐渐升高，并且三者在IDC、DCIS和Snail mRNA表达显著高于ANBT 组，提示其高表达促进了乳腺癌变。

(2) Notch1、N1IC和Snail mRNA的高表达均与淋巴结转移和TNM高分期显著正相关，并且Notch1和N1IC mRNA高表达与组织学高分级也呈显著正相关，说明Notch1通路相关分子可能促进了乳腺癌的进展。

(3) Notch1-N1IC-Snail信号轴中基因mRNA表达的显著正相关性提示这三者可能在乳腺癌的发生、进展中发挥协同促进作用。

关键词：Notch1，N1IC，Snail，mRNA，乳腺癌
Abstract
Objective:To explore the significance of Notch1 and Snail in the development of breast carcinoma, the mRNA expressions of Notch1, N1IC and Snail were analyzed in adjacent normal breast tissue (ANBT), atypical ductal hyperplasia (ADH), ductal carcinoma in situ (DCIS) and infiltrating ductal carcinoma (IDC).
Methods: The mRNA expressions of Notch1, N1IC and Snail were measured by qRT-PCR from 80 IDC, 20 DCIS, 15 ADH and 25 ANBT tissues. The correlations between three gene mRNA expression were further analyzed. The correlation between the three genes mRNA expression with clinicopathological features in IDC were analyzed, and relativity between the three genes expression combined with the previous findings of protein expression.
Results:(1)Notch1 mRNA expression in ANBT (0.55±0.26), ADH (0.81±0.34), DCIS (1.79±0.62) and IDC(2.42±0.99) were gradually increased, the significantly statistical differences (P=0.000, P=0.000) while IDC and DCIS groups compared with ANBT group respectively, The positive correlation between Notch1 mRNA expression and histological grade (P=0.000), lymph node metastasis (P=0.000) and TNM stage (P=0.02), Notch1 mRNA and protein expression (previous results) showed a significant positive correlation (r=0.404, P=0.000);(2)The increasing tendency of N1IC mRNA expression in four groups is consistent with Notch1 expression(ANBT:0.70±0.32,ADH:1.05±0.44, DCIS: 2.09±0.75, IDC: 2.19±0.97), there were significantly statistical differences (P=0.000, P=0.000) while IDC and DCIS compared with ANBT, N1IC mRNA expression positive correlated with histological grade (P=0.000), lymph node metastasis (P=0.000) and TNM stage (P=0.03), N1IC mRNA and protein expression showed a significant positive correlation (r=0.332, P=0.003); (3)Snail mRNA expression were increasd in breast tissues(ANBT：0.55±0.36，ADH：1.06±0.43，DCIS：2.18±0.77，IDC：2.51±0.98), there were significantly statistical differences (P=0.000, P=0.000, P=0.001) while IDC, DCIS and ADH compared with ANBT, furthermore, The positive correlation between Snail mRNA expression with lymph node metastasis (P=0.001), TNM stage (P=0.000),The positive correlation o f Snail mRNA and protein expression (r=0.217, P=0.054) was no statistical significance. (4)Three genes mRNA expression in four breast tissues (IDC: r=0.235，P=0.036; DCIS: r=0.554，P=0.032; ANBT: r=0.522，P=0.018) showed a significant positive correlation.
Conclusions: (1) The mRNA expressions of Notch1, N1IC and Snail were gradually increased during breast canceration, suggesting a potential role in the initiation of breast cancer. (2) expressions of three genes positively associated with lymph node and TNM stage, Notch1 and N1IC expression positively associated with histological grade, its may be promote the progression of breast cancer patients. (3)Notch1-N1IC-Snail expression significantly positively related in four breast tissues may play a synergy role in the metastasis of breast cancer.
Key words: Notch1, N1IC, Snail, mRNA, Breast cancer
目录
中文摘要 (I)
英文摘要 (II)
英文缩略词表 (Ⅳ)
前言 (1)
材料与方法 (4)
1 材料 (4)
2实验方法 (7)
3数据分析方法 (9)
结果 (10)
1 Notch1 mRNA表达与乳腺癌变、进展的相关性 (10)
2 N1IC mRNA表达与乳腺癌变、进展的相关性 (14)
3 Snail mRNA表达与乳腺癌变、进展的相关性 (18)
4 Notch1、N1IC和Snail mRNA在乳腺癌变过程组织中的表达相关性 (22)
讨论 (24)
结论 (30)
参考文献 (31)
文献综述 (35)
致谢 (43)
作者简介 (44)
导师评阅表 (45)
英文缩略词表
英文缩写英文全名中文译名IDC Invasive ductal carcinoma 浸润性导管癌DCIS Ductal carcinoma in situ 导管原位癌ANBT Adjacent normal breast tissue 癌旁正常组织
ADH NICD
N1IC
ER
PR
HER-2 qRT-PCR
DEPC TNM Atypical ductal hyperplasia
Notch intracellular domain
Notch1 intracellular domain
Estrogen receptor
Progestrone receptor
Human epidermal growth factor receptor-2
Quantitative Real-time
polymerase chain action
Diethylprocarbonate
Tumor Node Metastasis
非典型导管增生
Notch信号胞内段
Notch1受体胞内段
雌激素受体
孕激素受体
人表皮生长因子受体2
定量反转录聚合酶
连锁反应
焦碳酸二乙酯
临床病理分期
IHC Immunohistochemistry 免疫组织化学PBS Phosphate Buffer Solution 磷酸缓冲液SPSS Statistics Package for Social Science 统计软件EMT Epithelial-mesenchymal transition 上皮间质转化
前言
(Introduction)
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，以29%的发病率高居女性恶性肿瘤之首，同时，其高达14%的死亡率也充分证明了乳腺癌严重危害女性生存及生活质量[1]。

最新调查显示2013年中国乳腺癌发病率约为16/100000，尤其在我国经济较发达的省市，其乳腺癌发病率明显增高[2, 3]。

伴随着科技发展及研究的深入，虽然各项靶向治疗以及肿瘤筛查项目的开展，中国地区乳腺癌的发病率及死亡率仍逐年增长，呈年轻化趋势[4]。

按组织学分类，乳腺普通型导管增生（usual ductal hyperplasia，UDH）、非典型导管增生（atypical ductal hyperplasia，ADH）和导管原位癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）属于乳腺导管上皮增生性病变[5]。

普通性增生属于良性增生病变，非典型增生是一种交界性疾病，导管原位癌是一类早期恶性病变，进一步发展为浸润性导管癌（infiltrating ductal carcinoma，IDC），而浸润性导管癌是最常见的组织学类型，因此，乳腺癌的发生发展通常从正常乳腺上皮组织到普通型导管增生，非典型导管增生，导管原位癌到浸润性导管癌一个长期的由良性向恶性发展的过程。

乳腺癌的侵袭转移仍然是造成患者死亡的主要原因，寻找有效评估乳腺癌发病风险及判断治疗和预后的相关分子标记物成为乳腺癌研究的主要目的和手段。

近几年因分子生物学迅速发展，细胞信号通路、癌基因及抑癌基因的研究为乳腺癌变、进展机制以及临床诊断和治疗提供了更多的理论依据｡
乳腺癌发生发展是由多条信号通路参与的复杂过程，近几年有不少学者研究发现Notch信号通路与乳腺癌变过程有关。

Notch信号通路普遍存在于脊椎动物和非脊椎动物中，在进化上高度保守，经过相邻细胞间的相互作用从而调节细胞、组织及器官的分化和发育[6]。

Notch信号通路由Notch受体、Notch配体、CSL DNA结合蛋白、下游转录因子Snail、Slug等以及调节因子等构成。

1917年，Morgan和同事发现基因突变的果蝇中存在Notch基因，因为缺乏该基因的部分功能会在果蝇翅膀的边缘造成缺刻（Notch）而命名。

哺乳动物中Notch受体有4类（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）和Notch配体5类（Delta-like 1, 3, 4，Jagged1和Jagged2）。

Notch信号的产生是Notch配体与相邻细胞之间的Notch受体发生作用，Notch受体经过三次蛋白水解，形成胞内段NICD（Notch intracellular domain）释放入胞质，然后进入胞核与转录因子CSL结合后组成NICD/CSL转录激活复合体，从而激活Snail、Slug、HES、HEY、HERP等转录抑制因子家族的靶基因，参与细胞生物学行为的调控[7, 8]。

Notch信号通路不仅参与乳腺的正常发育及功能发挥，并且乳腺干细胞的自我更新调节机制失调可以导致乳腺癌的发生[9]。

在Notch信号通路分子中，Notch1 受体的研究最多见，并与肿瘤发生发展密切相关[10]。

文献报道，1991年Notch1基因在人类T淋巴母细胞白血病中首次被发现，提示其与肿瘤相关。

近年来，Notch1与乳腺癌的关系已成为一个研究热点。

有学者研究发现，Notch1 和Jagged1基因在人乳腺癌中呈过表达, 提示被异常激
活的Notch1信号通路可能促使乳腺癌的发生[11]。

Parr等人研究也证实，乳腺癌Notchl的表达与癌旁正常组织其表达相比，呈明显增高趋势，进一步分析后显示，Notchl可能是乳腺癌一个不良的预后因子[12]。

Zang S等在乳腺癌细胞中使Notch1表达下调，发现Notch1信号得下调可导致癌细胞生长抑制[13]。

上述文献研究结果显示Notch1扮演癌基因角色，促进乳腺癌发生发展。

课题组也做了一些前期研究工作，花本林等分别对乳腺不同阶段乳腺石蜡组织中Notchl蛋白的表达水平进行研究，发现在乳腺组病变过程中，Notchl蛋白及mRNA 表达的水平逐渐升高，在浸润性导管癌中的表达水平最高，说明浸润性导管癌的癌变、进展过程可能与Notchl高表达有关；研究还发现浸润性导管癌中Notch1蛋白表达与淋巴结转移、组织学分级及TNM分期都有显著的相关性，提示Notchl蛋白高表达可能加剧了乳腺癌浸润和转移[14]。

课题组孙建平同学前期还检测了乳腺癌及乳腺癌旁正常组织中Notch1及EMT相关分子的蛋白表达，结果显示Notch1分子参与乳腺癌EMT的发生，且促进了乳腺癌的转移[15,16]。

Notch1蛋白表达受到遗传学和表观遗传学的调控，其中课题组成员发现乳腺组织中存在Notch1 基因多态性，并与蛋白表达有关，浸润癌和原位癌组中rs3124591 TC 基因型频率显著高于普通型增生组，这表明Notch1基因SNP可能与蛋白表达变化有相关性[17]，并且课题组张娜[18]研究发现，乳腺癌患者中Notch1基因低甲基化，其蛋白及mRNA 表达增加，这种负相关说明Notch1的低甲基化致使其蛋白表达升高。

综上所述，课题组前期研究结果与文献报道结果相一致，即Notch1蛋白高表达与乳腺癌发生发展正相关，并且其蛋白表达与甲基化修饰和SNP有相关性。

但是关于Notch1 mRNA 在乳腺癌变过程组织中的表达变化及意义以及甲基化和SNP是否通过影响mRNA表达进而影响其蛋白表达则有必要进一步研究验证。

Notch1通路活化的标记分子是N1IC（Notch1 intracellular domain），N1IC分子的形成或表达增多说明Notch1通路活化或活化增强。

关于N1IC分子和乳腺癌的相关性研究，目前仅有少量文献报道。

Ma[19]等研究发现，乳腺癌组织中N1IC蛋白水平均明显高于非癌组织，且与患者的TNM分期密切相关。

Jin[20]等研究发现N1IIC蛋白表达在三阴乳腺癌组织中的表达明显高于非三阴乳腺癌，提示N1IC高表达可能与乳腺癌的恶性程度有关。

上述文献报道显示N1IC促进乳腺癌发生发展。

此外本课题组成员万国兴检测了乳腺癌变过程组织中的N1IC蛋白表达，发现N1IC蛋白表达在乳腺癌变过程中逐渐升高，且与淋巴结转移显著相关，与文献报道相一致。

此外，N1IC基因表达与胃癌[21]和白血病[22]的研究结果也显示N1IC蛋白高表达促进胃癌转移，并抑制分化，促进T-ALL细胞增生及浸润，进一步说明N1IC蛋白不仅在乳腺癌而且在其他恶性肿瘤中均发挥促癌作用。

虽然N1IC蛋白在乳腺癌中有研究报道，然而N1IC基因的mRNA在乳腺癌变过程中的表达状况以及与乳腺癌浸润、转移的相关性研究目前未见明确报道，值得我们进一步研究。

Notch1信号通路下游的众多转录因子之一是锌指转录因子Snail。

人类Snail蛋白在胎盘及成人心、肺、脑、肝和骨骼肌中均存在，具有调节机体生物功能的作用，例如细胞分化、游动、循环和细胞凋亡。

Snail在胃癌[23]、宫颈癌[24]、结直肠癌[25]、前列腺癌[26]和肝癌[27]等许多肿瘤中呈高表达，并与胃癌、头颈部鳞癌[28]组织学分级、淋巴结转移及远处转移有
显著相关性。

在乳腺癌组织中，Come等发现Snail主要表达于细胞核，而正常组织中表达则较少，且Snail高表达与乳腺癌低分化、淋巴结转移显著相关[29]。

Lundgren等研究发现，乳腺癌细胞株中Snail蛋白为过表达，迁移运动能力明显增强，反而Snail低表达的癌细胞运动能力则大大减弱[30]，并且Snail蛋白高表达促进EMT表型分子E-cadherin表达，下调N-cadherin和Vimentin的蛋白表达[19,20,29]，结果表明Snail通过EMT促进乳腺癌转移。

本课题成员万国兴在乳腺癌旁正常组织、导管普通型增生、导管原位癌及浸润性导管癌组织中用免疫组化方法检测Snail蛋白表达，并联系其临床病理特征及EMT相关分子的表达情况，提示Snail蛋白过度表达促进了乳腺癌发生进展。

本实验中，我们在乳腺组织中检测Snail mRNA表达，进一步验证上述研究结果。

目前，Notch1信号通路受体分子Notch1、通路活化标记分子N1IC和下游转录因子Snail 与乳腺癌发生进展的相关性研究未见明确报道，本课题组成员万国兴研究了Notch1、N1IC 和Snail蛋白在乳腺癌组织中的表达，结果显示这三个蛋白显著正相关性高表达并与乳腺癌发生发展正相关，提示Notch1、N1IC及Snail蛋白高表达可能促进乳腺癌变和进展，然而课题组只在蛋白水平上检测了Notch1、N1IC及Snail的表达，但Notch1、N1IC及Snail 的mRNA在乳腺癌中的表达状况与乳腺癌的临床病理特征(发病年龄、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期、ER、PR、HER-2等)之间的关系尚不清楚，我们认为可能需要进行研究。

结合文献报道和我们前期研究结果，由此提出假设：Notch1信号通路中Notch1、N1IC 和Snail基因的mRNA表达是否在乳腺癌变过程组织中逐渐高表达？是否与浸润癌的分级、淋巴结转移、分期等乳腺癌进展的指标有相关性？是否与蛋白表达趋势一致？这三个基因之间的表达在乳腺癌变组织中有无正相关性？
故本实验应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法对乳腺癌变过程的石蜡包埋组织中Notch1、N1IC和Snail基因的mRNA表达进行检测，并结合课题组前期的蛋白表达结果，分析Notch1、N1IC和Snail mRNA表达在癌旁正常乳腺组织、非典型导管增生、导管原位癌、浸润性导管癌组织中的表达变化，进一步分析其与乳腺癌临床病理参数的相关性，并且分析Notch1、N1IC和Snail mRNA表达之间的相关性以及这三个指标mRNA和蛋白表达的相关性，为探讨Notch1、N1IC和Snail基因mRNA表达在乳腺癌发生发展中的作用和为乳腺癌患者临床诊疗以及预后评估提供一定的实验基础。

材料与方法
(Materials & Methods)
1 实验材料
1.1研究对象
收集石河子大学医学院第一附属医院病理科2000年1月至2010年9月间乳腺石蜡包埋组织共140例：患者均为女性，年龄31-80岁，51岁为女性绝经分界年龄，51岁以上的乳腺癌患者通常预后较差，绝经较晚（51岁以后绝经），是公认的发病危险因素。

其中乳腺浸润性导管癌（IDC）80例，乳腺导管原位癌（DCIS）20例，乳腺非典型导管增生（ADH）15例，癌旁正常乳腺组织（Adjacent normal breast tissue，ANBT）（至少距肿瘤损伤5cm以上）25例。

所有患者无术前化疗、放疗或免疫治疗等治疗。

所有病例均经组织病理学检查，并由两位高年资病理医生阅片后确诊。

同时收集整理乳腺癌患者年龄、组织学分级、病理分期、淋巴结转移以及ER、PR、HER-2的表达情况等主要临床病理资料。

乳腺浸润性导管癌的具体临床病理特征如下表（表1）。

组织学分级和分型按照乳腺癌病理诊断标准参照2003年版WHO《乳腺及女性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》标准进行。

腺管和腺体形成”计分+“核多形性”计分+“核分裂计数”计分=总计分，根据总计分结果判定组织学分级。

I级，高分化：3～5分；II级，中分化：6～7分；III级，低分化：8～9分。

临床病理分期参照WHO最新版《乳腺及女性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》TNM 分期系统标准进行分期。

TX：原发肿瘤情况无法评估；T0：原发肿瘤未查出；Tis：原位癌；T1：肿块最大径<2cm；T2：肿块最大径2.0-5. 0cm ；T3：肿块最大径>5.cm ；T4：不论肿瘤大小，均出现直接侵犯胸壁或皮肤；NX：区域淋巴结情况无法分析；N0：未查出区域淋巴结转移；N1：同侧腋窝淋巴结转移，可活动；N2：同侧腋窝淋巴结出现转移，且淋巴结融合或与其他组织固定；M0：无远处转移；M1：出现远处转移（包括锁骨上淋巴结转移）。

0期：TXN0M0；Ⅰ期：T1N0M0；Ⅱ期：T0N1M0~任何TN3M0；Ⅳ期：任何T任何NM1。

ER、PR结果判定标准按照《乳腺癌雌激素受体和孕激素受体免疫组化检测指南》：癌细胞胞浆和或核内有棕黄色细颗粒者为ER、PR阳性细胞，阳性细胞<1%为阴性，≥1%视为阳性；根据《乳腺癌HER2检测指南》，HER2阳性为免疫组化判定为3+者；HER2免疫组化为2+者，加做FISH，扩增者认为阳性，否则为阴性；免疫组化为1+/-者，认为HER2阴性。

表1 乳腺浸润性导管癌临床病理学特征
参数例数百分比（％）
年龄＜51岁31 38.8 ≥51岁49 61.2
组织学分级高分化 1 1.2 中分化52 65.0 低分化27 33.8
淋巴结转移
有转移36 45.0
无转移44 55.0 TNM分期
早期(I-Ⅱ期) 52 65.0
晚期(Ⅲ-Ⅳ期) 28 35.0
ER 阳性(+) 40 50.0 阴性(-) 40 50.0
PR 阳性(+) 39 48.8 阴性(-) 41 51.2
HER-2
阴性（-/1+/2+）59 73.8
阳性（2+/3+）21 26.2 1.2所用主要试剂及耗材
(1) Trizol（美国Ambion 公司）
(2) Reverse Transcription Kit（德国QIAGEN公司）
(3) SYBR®Green PCR Kit （德国QIAGEN公司）
(4) 蛋白酶K（美国Sigma公司）
(5) 无水乙醇（天津富宇精细化工有限公司）
(6) 三氯甲烷（天津富宇精细化工有限公司）
(7) 异丙醇（天津富宇精细化工有限公司）
(8) DEPC水（北京天根生化科技公司）
(9) RIPA真核细胞裂解液（百泰克公司）
(10) 无酶枪头：1 ml、200 µl、10µl（上海生工）
(11) 无酶EP管：2.0ml、1.5 ml、200 µl（上海生工）
1.3实验试剂配制
(1) 细胞裂解液：每100g组织中加入1ml RIPA和10µl PMSF（注意：PMSF现用现加，否
则易失去效能），将样品在4℃11000rpm离心15-20min，将上清液转移至干净的无酶EP 管中，-20℃保存。

(2) 蛋白酶K：将100mg的蛋白酶K粉末缓慢加入到5ml高压灭菌的双蒸水中，轻轻混匀，
直至完全溶解。

然后放入干净的无酶EP管中储存在-20℃，避免反复冻融。

1.4实验所用仪器
(1) Biofuge Stratos 台式高速冷冻离心机（美国Thermo 公司）
(2) 高压蒸汽灭菌锅（日本三洋公司）
(3) 60℃烤箱和37-45℃恒温孵育箱（北京永光明医疗器械厂）
(4) -80℃低温冰箱（美国Thermo 公司）
(5) 4℃和-20℃冰箱（青岛海尔公司）
(6) YKKY-FM70颗粒制冰机（北京长流科学仪器有限公司）
(7) 实时荧光定量PCR仪Applied Biosystems 7500（美国Life Technologies公司）
(8) 紫外分光光度仪NANO DROP 2000（美国Thermo 公司）
(9) 台式离心机（上海精密仪器厂）
(10) 数显恒温水浴（北京永光明医疗仪器厂）
(11) 石英自动双重纯水蒸馏器1810-B型（江苏丹阳门石英玻璃厂）
(12) 漩祸震荡器XW-80A（江苏海门市其林贝尔公司）
1.5 实时荧光定量PCR 引物
1.5.1 引物设计：PCR 引物包括目的基因Notch1 引物、N1IC 引物、Snail 引物及内参基因β-actin 引物。

设计引物步骤如下：打开PubMed主页，选择“NCBI Web Site”，点击“blast”，输入参考文献中上下游引物序列，分别选择种属及各项参数后点击“blast”按钮，选择合适序列。

引物序列分别为：
Notch1：Forward: TGGACCAGATTGGGGAGTTC
Reverse: GCACACTCGTCTGTGTTAC
N1IC：Forward: GCAGTTGTGCTCCTGAAGAA
Reverse: CGGGCGGCCAGAAAC
Snail: Forward : TTACCTTCCAGCAGCCCTAC
Reverse: GACAGAGTCCCAGATGAGCA
β-actin: Forward : CTCCATCCTGGCCTCGCTGT
Reverse: GCTGTCACCTTCACCGTTCC
1.5.2 引物合成：以上引物均由上海生工有限公司合成。

2 实验方法
2.1实时荧光定量RT-PCR实验
2.1.1石蜡组织总RNA的提取
(1) 将5µm厚连续切片的蜡膜放于2ml的无酶EP管中，加入1.5ml 二甲苯，上下充分
摇动5min，55℃孵育10min，10000rpm，23℃，离心8min，重复1-2次；
(2) 弃上清后加入1.5ml无水乙醇，充分摇匀10min，13000rpm，4℃11min，重复一次；
(3) 弃上清后室温放置干燥15min；
(4) 加入250µl细胞裂解液，轻轻混匀，加入蛋白酶K 50µl，置55℃水浴锅内过夜；
(5) 第二日，加蛋白酶K 20µl，直到液体清亮（若液体浑浊再加蛋白酶K，总量＜100µl）；
(6) 将水浴锅提前进行升温，95℃水浴灭活蛋白酶K，5min，9000rpm，4℃，离心11min，
取上清液，记录液量；
(7) 加入1ml Trizol，轻轻摇匀5min，在冰上静置10min，使样品充分裂解；
(8) 加入等体积的三氯甲烷，剧烈震荡EP管将其混匀15s后在室温下放置10min，使其
自然分相；
(9) 13000rpm，4℃，离心16min，液体会分成三层：表层(无色)主要含RNA，中间层(白
色膜状)主要为蛋白质，下层(红色)主要为DNA和其他有机物成分。

应小心用200µl 枪头将无色上清液移至另外一个新的1.5ml的无RNA酶的EP管中，记录上清液的体积。

注意：不要吸到中间层，否则会在RNA样本中引起DNA污染；
(10) 在上清中加入等量的异丙醇，上下摇晃均匀后在室温下静置10min；
(11) 置于-20℃冰箱中30min使其沉淀；
(12) 13000rpm，4℃，离心11min，去除上清，此时在EP管底可观察到白色RNA沉淀物；
(13) 加入1ml预冷无水乙醇，温和振荡EP管，悬浮沉淀，上下颠倒数次漂洗RNA，
13000rpm，4℃，离心6min，用200µl枪头小心吸取上清，注意不要吸到沉淀。

将沉淀放置于室温下干燥10min。

注意：切勿将RNA样品过分干燥，否则难以溶解；(14) 在沉淀中加入10-50µl RNase-free水，充分溶解RNA30min，-20℃保存或进行下一
步实验。

2.1.2 cDNA的合成和qRT-PCR反应
按照Reverse Transcription Kit及SYBR Green PCR Kit说明书配制逆转录和实时荧光定量PCR反应体系，未经逆转录的RNA易降解，需在冰上操作以减少对RNA的降解。

Notch1和Snail为目的基因，β-actin为内参基因，通过2-△Ct法计算Notch1及Snail基因
mRNA表达水平，其中△Ct为目的基因的Ct值减去内参基因的Ct值，亦即△Ct=Ct
-Ct β-actin。

Ct值为反应的实时荧光强度达到设定的阈值时所经过的扩增循环数，Notch1/Snail
此时扩增是呈对数期增长，试验重复3次。

(1)逆转录反应体系：
试剂体积
gDNA Wipeout Buffer,7×2ul
Template RNA, up to 1ug* 可变
RNase-free water 可变
总反应体系14ul
42℃孵育2min，立即置于冰上；
试剂体积
Quantiscript Reverse Transcriptase 1ul
Quantiscript RT Buffer,5×4ul
RT Primer Mix 1ul
Template RNA（上一步）14ul
总反应体系20ul
42℃孵育15min，95℃孵育3min，-20℃贮存。

(2)实时荧光定量qRT-PCR反应体系：
试剂体积
2×QuantiFast SYBR
Green PCR Master Mix 10ul
Primer A* 2ul
Primer B* 2ul
RNase-free water 4ul
Template cDNA 20ul
总反应体系20ul
(3)实时荧光定量qRT-PCR反应条件：
预变性95℃5min 1 Cycle
变性95℃10s
退火和延伸62℃30s 40 Cycles
2.1.3 注意事项：
(1) 在实验过程中需频繁更替手套。

由于皮肤上常会沾染细菌，会导致RNase污染。

(2) 为避免污染，操作台和实验所需全部耗材在使用前应用紫外灯消毒半小时。

(3) RNA在TRIzol试剂中不会被RNase污染，但在三氯甲烷分层后的上清中已没有了
RNase的抑制剂，所以分层后的所有操作应格外小心，保证所使用的EP管和枪头必须是无酶的。

(4) 移液枪使用完毕之后一定归到最大计量的位置，避免长此以往弹簧失去弹性。

(5) 因SYBR Green PCR 试剂盒中含有荧光染料，储存或配置PCR反应液时应注意避光
保存。

(6)Reverse Transcription 试剂盒及SYBR Green PCR 试剂盒在使用时短暂离心后应置于
冰上操作，不要反复冻融，反复冻融使试剂性能下降，使用完毕后应尽快放回-20℃。

(7) 应按照正确的开关机顺序操作，有助于延长机器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。

3 统计学分析
所有实验数据均用SPSS17.0统计软件分析，数据以（ x±s）表示。

经单样本K-S检验，判断是否正态分布；两样本均数和多样本均数比较，方差不齐时进行秩和检验统计学分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

Notch1、N1IC及Snail在乳腺组织中的表达与患者年龄、TNM分期、组织学分级、是否有淋巴结转移等临床病理参数之间的比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

分析浸润性导管癌中Notch1、N1IC与Snail的mRNA表达量与蛋白表达的相关性，先应用卡方检验分析数据，当P＜0.05后，再采用Pearson方法分析mRNA表达量与蛋白表达的相关性。

三者mRNA表达之间的相关性采用Pearson方法。

实验图标采用GraphPad.Prism5.02 软件制作，以P＜0.05 为具有统计学差异。

结果
(Results)
1 Notch1 mRNA表达与乳腺癌变、进展的相关性
1.1 Notch1 mRNA在乳腺癌变过程组织（ANBT、ADH、DCIS、IDC）中的表达
Real-time qRT-PCR实验中，设计β-actin作为内参基因所依据的原则是β-actin在不同实验条件或标本种类中，其表达的比值水平基本一致，基因间的表达丰度和极端比值对β-actin表达不产生影响。

β-actin扩增曲线的线条圆滑，跨度适中，为单一溶解峰，未见其他杂峰信号，溶解温度为78℃左右，β-actin的扩增曲线和溶解曲线见图1。

A: 扩增曲线
B:溶解曲线
图1 乳腺组织中β-actin生成的部分扩增曲线(A)和溶解曲线(B)
Notch1 mRNA在四组乳腺组织中的表达之扩增曲线和溶解曲线见图2。

通过7500 PCR仪自动生成的扩增曲线可以看到目的基因Notch1扩增曲线的线条圆滑，跨度适中，提示扩增表达情况良好（图2A）。

从溶解曲线图（图2B）上可以看出，Notch1曲线为单一溶解峰，未见其他杂峰信号，溶解温度为76℃左右，与β-actin溶解温度差异不大，说明产物特异性较好，非特异产物对结果影响不大，从而可认为Notch1逆转录引物、扩增引物和PCR 参数能够特异的扩增出Notch1片段。

A: 扩增曲线
B:溶解曲线
图2 乳腺组织中Notch1生成的部分扩增曲线(A)和溶解曲线(B)
Notch1 mRNA分别在浸润性导管癌（IDC）、导管原位癌（DCIS）、非典型导管增生（ADH）和癌旁正常乳腺组织（ANBT）各组中的表达量分别为 2.42±0.99、1.79±0.62、0.81±0.34和0.55±0.26（表2），呈逐渐下降趋势，且四组之间mRNA表达的差异具有统计学意义（P=0.000）（图3）。

Notch1 mRNA在四组中的表达进行两两比较结果显示：。