脑原位缺血预处理通过Nrf2HO-1信号通路减轻大鼠缺血再灌注损伤

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〔20196960修回〕
(编辑王一涵)
脑原位缺血预处理通过NUU/HOA信号通路减轻大鼠缺血再灌注损伤
王欢欢王刚仲婷婷孙健贺宏梅寇文辉宋爱霞邹玉安薛茜
（河北北方学院附属第一医院神经内科，河北张家口077700）
〔摘要〕目的研究脑原位缺血预处理（CISC）对大鼠脑缺血再灌注损伤后核因子E2相关因子（NU）2/血红素加氧酶（HO）T信号通路的影响。

方法SPF级雄性SD大鼠-4只，随机分成假手术组（sham组、、缺血再灌注组（model组）、缺血预处理组（CISC组、，对model组和CISC组采用线栓法制作脑缺血再灌注模型。

CISC组于缺血再灌注模型制作前3d行右侧颈内动脉短暂性血流阻断14mw o每组大鼠分别于术后047424347U对其进行改良Gaum J H评分评估各组动物神经缺损的严重程度。

苏木素-伊红（HE）染色观察各组大鼠脑组织梗死灶神经元的变化。

免疫组化观察各组大鼠脑组织NUU核转移情况。

qRT-PCR检测各组大鼠组间NU8、HOC mRNA表达差异。

结果脑原位缺血预处理能提高缺血再灌注后2448和72U神经功能评分，差异有统计学意义（P<4.45）o脑原位缺血预处理能提高缺血再灌注损伤各时间点N/U核转移数（NUU 及HOT mRNA的表达量，差异有统计学意义（P<4.45,P<4.4）、。

结论CISC可能通过激活NrU/HOC信号途径，促进抗氧 化蛋白HOC的表达，减轻脑组织的损伤，从而发挥对缺血再灌注损伤的保护作用。

〔关键词〕缺血预处理;缺血再灌注;核因子E0相关因子0；血红素加氧酶A；氧化应激
〔中图分类号〕R773.0〔文献标识码〕A〔文章编号〕1375-0200（2001）07-907795:doi:10.0362/j.issn.1375-0200.2001.07.033
急性缺血性脑卒中是最常见的脑卒中类型，占
我国脑卒中的07.0%-70.8%〔6〕，已严重危害当今社会中老年人的健康和生命，每年约有数百万人新发脑卒中。

目前急性脑梗死的特异性治疗包括改善脑血循环（静脉溶栓、血管内治疗、抗血小板、抗
基金项目:河北省卫生厅科研基金项目（20180846-;张家口市重点研发计划项目（192-28H）
通信作者：薛茜（1798-）,女，硕士，主任医师，主要从事脑血管病研究。

第一作者:王欢欢（1036-）,女，硕士，住院医师，主要从事脑血管病研究。

凝、降纤、扩容等方法）、他汀及神经保护等〔〕。

其中静脉溶栓现认为有效抢救半暗带组织的时间窗为4.0U内或7U内〔〕，随着DAWN或DEFUSE A研究急性前循环大血管闭塞的时间窗被扩展到17或24P3〕，但由于严格的适应证和短暂的时间窗限制,以上治疗仅适用于少数患者。

因此还需要进一步了解缺血病理过程的复杂机制来开发缺血性疾病的内源性保护机制。

以往研究证实，脑缺血再灌注损伤的发病机理有若干因素包括：（1-兴奋性氨基酸毒性作用；（0）Cu2+超载；（3）线粒体损伤;（4）氧化应激;（3）炎症损伤；（6）细胞凋亡等,而氧化应激损伤
是脑缺血再灌注损伤的核心病理环节。

目前，急性缺血性脑血管病内源性保护机制的研究受到广泛关注,通过给予组织一个低于损伤剂量的刺激如缺血、低氧等，激活机体自身的内源性保护机制，已达到减轻严重损伤所带来的伤害〔〕。

这种机制主要包括缺血预处理和后处理,而缺血预处理又包括原位缺血预处理和远隔器官缺血预处理。

以往研究表明，众多的神经递质、蛋白及信号通路可能参与脑缺血预处理的过程，但其作用机制尚未完全明确"〕。

而核因子E2相关因子（NP）2/血红素加氧酶（HO-A 信号通路是内源性抗氧化应激的关键调控因子之一〔〕。

本研究旨在探讨脑原位缺血预处理是否可通过调控NU2/HO-1信号通路，提高缺血打击的耐受能力。

1材料与方法
1.1实验动物及分组250-230y雄性SD大鼠20只，由河北北方学院实验动物中心提供,并获得河北北方学院动物实验管理委员会批准。

实验动物中心室温（24±1）C、相对湿度（45±5）%、日光灯照射12h明暗交替。

将27只雄性SD大鼠编号并按随机数字表法分为假手术组（sham组-、缺血再灌注组（model组-、缺血预处理组（CISC组-，每组又分别分为术后6、1234、48和70h o
1.2模型制作及评价采用Zen-Covyn大脑中动脉线栓法建立大鼠模型〔〕。

大鼠水合氯醛腹腔注射全麻后，分离颈总、颈内、颈外动脉,结扎颈外动脉及颈总动脉近心端，从颈总动脉远心端将线栓送至颈内动脉（2±2）mm,2h后抽出线栓造成再灌注损伤。

CISC组行右侧颈内动脉短暂性血流阻断3min,J U后，同moPel组方法建立模型,sham组暴露并结扎血管，不插入线栓。

动物清醒后，参照Uni yn5级评分法筛选动物模型，选取1~3分的动物为造模成功。

1.2主要试剂MCAO栓线（北京西浓科技有限公司）；兔抗NU2多克隆抗体（美国Santa Cmz）；兔IgG 两步法免疫组织化学检测试剂盒（博士德生物-; RNAisa Plus（宝生物工程有限公司）；Fast Quan）RT KU（with gDNasa,天根生化科技有限公司）；Supar Real PreMio Plus）SYBR Green,天根生化科技有限公司。

1.2方法
1.4.1神经功能评分实验大鼠在术后6h、3h、27h35n32h进行改良Ga—id J H评分，包括：自主运动、体态、前肢伸展运动、抓持和攀爬铁笼能力、两侧身体触觉反射和两侧胡须触碰反应6部分内容,功能正常时得分最高,3分。

1.4.2苏木素-伊红（HE）染色、免疫组化检测NUO
将脑组织制成0p m厚的组织切片分别进行HE 染色和免疫组化,光学显微镜下进行观察。

1.4.2qRT-LCR方法检测NUO和HO-1mRNA的表达量麻醉大鼠，生理盐水进行心脏灌注,取缺血侧脑组织,在液氮中研磨充分后，按T/zoi试剂说明书提取总RNA,紫外分光光度计检验RNA纯度，要求波长在200nm和230nm处吸光度比值为05-
2.7o用RT逆转录试剂盒逆转录成cDNA,以cDNA 为模板，建立qPCR体系20p d反应条件为：95C预变性3mip,95C变性10s,退火66C3s,47个循环。

以0-hcXu为内参照，NU2上游引物：5'-CA-CATCCAGACAGACACCAGT6S下游弓|物：5，-CTA-CAAATGGGAATGTCTCTGC A S HOG上游弓|物5s GAACTGTGGTCGGTAGAGGCA S下游弓I物0，-AT-CAAAGTGGCCATGACGCT6S0-acku上游引物5s GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAA S下游引物5s GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA S
设置熔解曲线判断是否有非特异性的扩增。

校正每个样品的C）值，得ACt值。

以2-AA Ct法计算各组间mRNA的表达量。

AA Ci=各组（Ct目的基因-Ci0-hctiu--对照组（Ct目的基因-Ct0-actin-；2-AA Ct=各组基因表达量/假手术组基因表达量〔〕。

1.2统计学方法采用SPSS17.7软件进行t 检验。

2结果
2.1各组大鼠不同缺血再灌注时间改良Ga—in J H 评分比较moPel组和CILC组在各个时间点的神经缺损评分均明显低于sham组（均P<0.71）o再灌注27h、48h和72h时CILC组的神经缺损评分明显高于moPel组（均P<0.07），见表1o
2.2大鼠HE染色sham组大鼠神经细胞大而圆，形态规则，连接紧密。

model组6h出现细胞水肿，细胞周围间隙增宽，细胞间隙出现大小不等的空泡，无明显细胞坏死;3h时细胞明显水肿、上述症状逐渐加重;24、48h时神经元核固缩、浓染，神经元结构明显破裂、排列紊乱,细胞核呈深染、固缩，周围出现较大空泡，细胞坏死明显;92h时神经元水肿逐渐减轻，部分细胞出现不可逆性坏死。

CICC P 各时间点较缺血再灌注组均可见神经细胞缺血性改变减轻。

见图2
表1各组大鼠不同缺血再灌注时间改良611x0JH评分比较(元±,分，=6)组别012o24o48h72o sham组 4.50±0.5417.67±0.5313.83±0.5313.83±0.4317.67±0.52 mobei组7.33±0.5348.33±0.5249.33±052412.01±0.394 4.67±0.824 CIPC组
7.51±0.3548.51±0.35413.13±0.0542314.03±0.031323 4.67±0.52443与sham组比较：1)P<0.01;与mobei组比较/)P<0.05,5)P<0・01；下表同
图1各组大鼠脑梗死神经元形态变化(HE,x442)
2・4各组大鼠NP3表达情况sham组NP3表达无明显改变，在0h时model组及CIPC组NP3核着色的阳性细胞开始增多,24h达高峰,45h开始下降。

model组与CIPC组在各时间点NP3核阳性细胞数明显高于sham组(PV0.03)。

CIPC组在各个时间点Nki核阳性细胞数明显高于model组(P< 0.25,Pv0.01),见表2、图2o
表2各组大鼠不同缺血再灌注时间NC1表达情况比较(丘土，个/=6)
组别01224o48h72o sham组 6.33±3.39 4.54±0.677.50±0.607.50±0.857.13±0.60 mobei组23.13±0.05446.33±1.01403.83±2.87459.30±2.&452.17±1.744 CIPC组
27.30±3.0348)57.33±2.5742377.4±4.2542369.13±2.3342360.50±3.67423
2.4各组大鼠NP3和HOC mRNA表达情况shai组NP3、HOR呈低水平表达且随着时间的延长无明显变化。

model组2CIPC组NP3、HOR mR-NA在缺血0h时表达开始增加,24h时达到高峰, 48h开始下降；model组与CIPC组在各时间点Nrft,HOC mRNA的表达均明显高于sham组(P< 0.05,Pv0.03)。

CIPC组在各个时间点NU3、HOC mRNA的表达均明显高于model组(P<0.05,P< 0.03)o见表3
o
12h24h48h72h sham组
model组
CIPC组
6h
图0各组大鼠免疫组织化学染色(DAB,x447)
表9各组大鼠不同缺血再灌注时间Nrf2和HO9mRNA表达比较(c±s,n=9)
组别
NUO
6h3n24n43n72n
sham组002±2.04021±2.04 2.99±2.06 1.00±2.06、.04±0.23 moPel组、.76±2.0、2)、.83±2.092- 2.62±2.1、2- 2.07±2.072-086±2.032-CICC组 2.03±2.082)3- 2.53±2.070)9- 3.49±2.32)7- 2.72±0.082)7- 2.43±2.002)7-
组别
HOA
6h3n24n43n72n
sham组021±2.06006±2.23 2.99±2.47 2.93±0.04、.04±0.47 moPel组、.94±2.31-066±2.072- 2.51±2.22- 2.51±2.22-077±2.31-CIPC组33±2.32)8- 2.53±2.120)3) 4.04±2.32)7- 3.57±2.32)7- 2.69±2.32)7-与sham组比较：、-P<2.23,2)P<2.4、；与moPel组比较7-P<2.03,2)P<2.20
9讨论
缺血性脑卒中是由于脑血管阻塞导致血流供应障碍引起的脑卒中，脑细胞由于能量供应障碍引发了瀑布式级联反应导致脑细胞损伤〔i240。

目前关于脑缺血神经保护剂的研究众多，但结果尚存争议。

其主要原因在于目前研究主要针对单一靶点的药物，这与缺血性脑损伤瀑布式级联反应过程是相悖的。

因此努力探究全面的神经保护治疗方案至关重要。

Cor—io等〔2研究发现冠状动脉缺血预处理可引起再发心肌梗死,但其体积减小75%。

由此揭示了缺血再灌注损伤的内源性保护机制,并率先提出缺血预处理(ICC)的概念。

最开始，大多数学者对ICC研究的重点在如何增强心肌对缺血的抵抗力方面，后期大部分的实验证明ICC所带来的缺血耐受是一种较普遍的现象,可在各个器官中发生,包括心脏、大脑、肾脏、视网膜等〔2〕。

心肌和脑组织是相对缺血较敏感的组织，因此也是开展ICC最有希望的部位。

以往研究证实，众多的神经递质、蛋白和信号通路可能参与ICC的保护作用〔3《7〕。

在临床工作中，我们发现有TID病史的患者脑卒中发病率及卒中严重程度都有所下降，这一现象为研究脑缺血预处理提供了思路。

既往研究表明，NU2/HOA信号通路具有抗氧化应激损伤的重要作用〔5〕。

静息状态下i NPU与其抑制因子Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白(Keap)、在细胞质中耦联，处于相对抑制的状态〔宀2〕，当细胞缺血缺氧时,NUO与Keap、解离,NUO核转位并结合H0A o HOA在细胞应激过程中发挥抗氧化、抗炎的
作用。

此外，研究证实HOC还可作为细胞应激的保护性应答标志〔5p6"2〕o Tanabu等〔5〕发现，在脑缺血再灌注模型中，NU2的表达是一个动态变化的过程,NU2在缺血组织中0U时表达量上升J U时达到高峰,24h和70U时表达下降。

而在本研究中,脑缺血预处理也显著增加了Nue核转移阳性细胞的数量及NUU mRNA的表达，也呈现一动态变化过程，这与上述研究是一致的。

本研究结果推测CISC通过NU2/HOC信号通路对缺血再灌注损伤发挥神经保护作用。

本研究结果为缺血缺氧性脑病防治提供了新的治疗策略，有望改善病人预后。

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〔2019X267修回〕
(编辑杜娟)
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近期我编辑部发现多篇来自不同省份和不同单位及不同作者的文章内容完全雷同。

经调查，稿件涉嫌学术不端及中介恶意投稿，我编辑部已经对类似多起恶意投稿进行了大量取证,正在对由此给编辑部造成的不良影响进行追究,经核实后告知稿件有关作者单位、并对此不法人员倒卖稿件造成学术不端的情况诉诸法律。

希望广大作者坚决抵制学术不端，共同维护良好的学术环境。

《中国老年学杂志》编辑部。