犬尿氨酸信号通路的组成成分及对脊髓继发性损伤的影响

中国组织化学与细胞化学杂志
CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY
第28卷第6期2019年12月
V ol .28.No .6December .2019
〔收稿日期〕2019-04-10 〔修回日期〕2019-12-08〔基金项目〕海南省卫计委科教项目（18A200115）
〔作者简介〕
钟佳师，男（1988年），汉族，主治医师，本科 *通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：
fucegang005@
犬尿氨酸信号通路的组成成分及对脊髓继发性损伤
的影响
钟佳师1，郭祥2，刘亦恒2，符策岗3*
（1海南省临高县人民医院外四科（骨科），临高 571800；2中南大学湘雅医学院附属海口医院骨科中心，
海口570208；3上海市第六人民医院-海口骨科与糖尿病医院骨科，海口 570000）
〔摘要〕急性脊髓损伤（spinal cord injury, SCI ）发生时，损伤部位具有神经保护作用的M2型小胶质细胞/巨噬细胞转换成具有神经毒性的M1型，并分泌大量炎性介质，同时上调犬尿氨酸信号通路（kynurenine pathway, KP ）的犬尿氨酸3-羟化酶，引起兴奋性毒素喹啉酸（quinolinic acid, QUIN ）分泌，进一步促进神经炎症，最终加重脊髓继发性损伤。

这一过程还涉及血红素氧化酶1（heme oxygenase-1, HO-1）和红细胞相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）信号通路。

近年大量的研究发现，通过调节KP 抑制QUIN 可用于治疗神经性疾病和SCI ，本文就以上内容做一简要综述。

〔关键词〕脊髓损伤；神经炎症；犬尿氨酸信号通路；喹啉酸；细胞死亡；功能障碍
〔中图分类号〕R744 〔文献标识码〕A DOI ：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2019. 06. 012
Components and effect of kynurenine pathway on secondary spinal cord injury
Zhong Jiashi 1, Guo Xiang 2, Liu Yiheng 2, Fu Cegang 3*
(1Department of The Spinal Surgery, People’s Hospital of Lingao County in Hainan Province, Lingao 571800; 2.Department of orthopedics, Haikou People ‘s Hospital, Xiangya Medical College, Central South University, Haikou 570208; 3.Department of
orthopedics, Orthopedics and Diabetes Hospital in Haikou, Shanghai sixth People’s Hospital, Haikou 570000)
〔Abstract 〕Following the occurrence of acute spinal cord injury (SCI), M2 microglia/macrophages, which have neuroprotective function, convert into neurotoxic M1 type and secrete a large number of inflammatory mediators. Meanwhile, M1 microglia/macro -phages upregulate the kynurenine 3-monooxygenase (KMO) branch of the kynurenine pathway (KP), resulting in the production of excess excitotoxin quinolinic acid (QUIN), which promotes neurotoxicity and aggravates secondary injury of SCI finally. In addition, heme oxygenase-1 (HO-1) and nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) pathways are also involved in this process. Recent studies have acknowledged that inhibition of QUIN through regulating KP pathway can be used to treat neurological diseases and SCI. This article briefly reviews the related researches mentioned above.
〔Keywords 〕Spinal cord injury; neuroinflammation; kynurenine pathway; quinolinic acid; cell death; dysfunction
当中枢神经系统（central nervous system, CNS ）损伤时，持续的神经炎症反应会加重继发性损伤。

此外，损伤局部活化的免疫细胞(Th1)大量会分泌的干扰素-γ （interferon-γ, INF-γ）或感染相关的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS ），这将诱导具有神经保护作用的M2小胶质细胞/浸润性巨噬细胞转变为具有
神经毒性作用的M1表型并进一步激活犬尿氨酸信号通路（kynurenine pathway, KP ）并促进神经毒性物质喹啉酸（quinolinic acid, QUIN ）的分泌[1, 2]。

QUIN 能促进多种神经毒性反应，包括：显著的激活N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA ）受体、直接与游离铁离子相互作用形成毒性复合物、引起神经元Ga 2+内流、一氧化碳合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS ）活化、增加一氧化碳(NO)的产生、促进活性氧（reactive oxygen species, ROS ）等等。

这些神经毒性反应将破坏线粒体膜的稳定性、激活ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)、并引起烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide
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adenine dinucleotide, NAD+）过度消耗等等一系列不良事件，这些事件会引起恶性循环，比如线粒体功能障碍将促使KP偏向犬尿氨酸3-羟化酶（kynurenine 3-monooxygenase, KMO）分支而产生更多的QUIN，最终导致神经元细胞死亡[3, 4]。

1 犬尿氨酸信号通路是色氨酸代谢的主要途径
KP负责95%的色氨酸降解，QUIN和3-羟基犬尿氨酸（3-hydroxykynurenine, 3-OH-KYN, 3-HK）是主要的代谢产物（图1）[3]。

色氨酸在体内主要用于合成五羟色胺和褪黑素，当色氨酸需要分解代谢时，KP将被激活。

主要信号通路是：色氨酸在色氨酸双加氧酶和吲哚胺2,3-二氧酶的催化下生成犬尿氨酸，紧接着在犬尿氨酸3-羟化酶的帮助下生成3-羟基犬尿氨酸，接下来又在犬尿氨酸酶的帮助下生成3-羟基氨基苯甲酸，然后在3-羟基氨基苯甲酸加氧酶的催化下生成2-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛，最终生成QUIN（具有促炎作用）。

其他信号分支包括：犬尿氨酸在犬尿氨酸转氨酶的帮助下生成犬尿稀酸（kynurenic acid, KYNA）(具有神经保护作用)、3-羟基犬尿氨酸在犬尿氨酸转氨酶的帮助下生成黄尿酸、犬尿氨酸在犬尿氨酸酶的帮助下先生产邻氨基苯甲酸后再形成3-羟基氨基苯甲酸、2-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛在2-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛脱羧酶的催化下生产2-吡啶甲酸等等[5]。

其中值
图1 犬尿氨酸通路示意图。

ACMS，-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛；TDO，色氨酸双加氧酶；IDO，吲哚胺2,3-二氧酶；KAT，犬尿氨酸转氨酶；KYNU，犬尿氨酸酶；KMO，犬尿氨酸3-羟化酶；3-HAO，3-羟基氨基苯甲酸加氧酶；ACMSD，2-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛脱羧酶；QPRT，喹啉酸磷酸核糖基转移酶
Fig. 1 Schematic diagram of the kynurenine pathway. ACMS, 2-amino-3-carboxymuconate semialdehyde; TDO, tryptophan dioxygenase; IDO, in-doleamine 2,3-Dioygenase; KAT, kynurenine aminotransferase; KYNU, kynureninase; KMO, kynurenine 3-monooxygenase; 3-HAO, 3-hydroxyan-thranilic acid oxygenase; ACMSD, 2-amino-3-carboxymuconate semialdehyde decarboxylase; QPRT, quinolinic acid phosphoribosyl transferase
钟佳师等.犬尿氨酸信号通路的组成成分及对脊髓继发性损伤的影响
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得一提的是，QUIN是内源NMDA受体激动剂，而KYNA则是内源性NMDA受体拮抗剂，这两个代谢分支彼此互相竞争、互相制约[2]。

如果KP过度活化会引起QUIN的过度分泌，加剧神经毒性和神经损伤[6]。

此外，KP的另一种主要代谢产物3-HK及其下游产物3-羟基氨基苯甲酸（3-hydroxyanthranilic acid, 3-HAA）一开始被认为是神经毒性反应的代谢产物，现在发现它在氧化还原反应中也发挥重要的作用。

尽管3-HAA被证实能抑制胶质细胞分泌细胞因子和炎症趋化因子而发挥抗炎的作用，但是它另一方面又增加氧化还原应激反应并诱导神经细胞死亡[7]。

2 脊髓损伤时巨噬细胞和犬尿氨酸信号通路的变化
SCI预后差与损伤后具有促进增殖和修复等神经保护作用的M2型小神经胶质细胞/巨噬细胞（主要是巨噬细胞）转变为具有细胞毒性作用的M1型密切相关[8]。

M1型巨噬细胞能产生大量的促炎因子、活化 KMO并激活KP，产生大量的QUIN引发一系列神经毒性反应，最终导致细胞死亡和严重的神经后遗症（图2）[1]。

TNF-α、IL-1β、INF-γ、NO和超氧阴离子（O2-）等细胞因子在促使M2向M1转型中发挥重要的作用，他们都是活化KP （NO和O2-）或者KP下KMO 分支的产物（TNF-α、IL-1β和INF-γ）。

研究证实，促使细胞因子谱转向具有神经保护作用的M2型，对减少SCI继发性损伤，提高Basso Mouse Scale （BMS）评分至关重要[1, 2]。

需要注意的是，活化的M1型巨噬细胞在SCI分泌的QUIN是未活化状态下的204倍，因此，巨噬细胞、KP、QUIN以及神经毒作用之间的联系在近年受到了人们的广泛关注[9]。

图2 脊髓损伤中巨噬细胞、犬尿氨酸信号通路、QUIN和神经毒作用的关系。

TRP，色氨酸；IDO，吲哚胺2,3-二氧酶；KYN，犬尿氨酸酶；KMO，犬尿氨酸3-羟化酶；3-HK，3-羟基犬尿氨酸；KYNU，犬尿氨酸酶；3-HAA，3-羟基2氨基苯甲酸；3-HAO，3-羟基氨基苯甲酸加氧酶；QUIN，喹啉酸；TNF-α，肿瘤坏死因子α；INF-γ，干扰素γ；IL-1β, 白细胞介素1β；ROS，活性氧
Fig. 2 Relationship between macrophage, kynurenine pathway, QUIN and neurotoxicity in the spinal cord injury. TRP, tryptophan; IDO, indoleamine 2, 3-dioygenase; KYN, kynurenin; KMO, kynurenine 3-monooxygenase; 3-HK, 3-hydroxykynurenine; KYNU, kynureninase; 3-HAA, 3-hydroxy-anthranilic acid; 3-HAO, 3-hydroxyanthranilic acid oxygenase; QUIN, quinolinic acid; TNF-α, tumor necrosis factor-α; INF-γ, interferon-γ; IL-1β, interleukin-1β; ROS, reactive oxygen species
3 急性脊髓损伤中血红素氧化酶1与犬尿氨酸信号
通路和核因子红细胞相关因子2信号通路的关系
早期就发现活化的中性粒细胞能大量分泌
HO-1，且HO-1抑制剂能延迟SCI后运动功能的
恢复，预示着HO-1在SCI中发挥抗氧化的保护作
用[10, 11]。

Nrf-2-抗氧化反应元件（anti-oxidant re-
sponse, ARE）是HO-1的主要调节因子，静息状态
下Nrf-2待在细胞质内与Keap1蛋白结合处于失活
状态，当细胞受到外界刺激或内源性损伤时，可以刺
激Nrf-2表达并移位到细胞核内与ARE反应原件结
合并诱导HO-1的表达。

有趣的是，KP的代谢产物
QUIN和3-HK都能激活Nrf-2向细胞核转移，并激
发抗氧化作用，这无疑与之前描述中QUIN和3-HK
的神经毒性作用背道而驰[12]。

进一步的研究，通过
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将QUIN处理的大鼠纹状体切片后发现，Nrf-2的细胞核转移发生在1h后，减少脂肪过氧化作用是在3h 后[12]。

因此我们有理由相信，QUIN诱导的Nrf-2细胞核转移并不是直接的，我们更倾向于相信这是对QUIN诱导ROS后的一种补偿机制或者负反馈，是抗氧化防御系统的一部分。

4 犬尿氨酸信号通路与SCI治疗
研究发现，SCI发生5天后，QUIN在损伤局部升高超过10倍，KP的起始酶（也是限速酶）吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO-1）升高2倍，且值得一提的是，周围未受伤的部位没有发现这种变化[1]。

在SCI发生后，通过注射4-氯-3-羟基氰氨基甲酸酯（4-chloro-3-hydroxyanthranilate, 4-Cl-3-HAA）（一种3-羟基氨基苯甲酸加氧酶抑制剂）能有效阻断3-HAA转换成QUIN，最终显著降低神经功能的缺失[13, 14]。

但要取得这样良好的结果，必须在SCI局部白质的完整的条件下注射4-Cl-3-HAA 才能实现[14]。

进一步的研究发现，单剂量的4-Cl-3-HAA用于治疗SCI并不能达到上述相同的肢体感觉运动的恢复，这表明4-Cl-3-HAA的疗效得益于长期的使用以减少QUIN在局部的聚集，而不是单纯的早期抗氧化作用[15]。

但是，4-Cl-3-HAA并不能显著提高具有神经保护作用KYNA的表达，研究发现，定向微量注射KYNA能显著改善SCI后肢体功能的恢复，主要是因为KYNA的衍生物，葡萄糖胺，能促进SCI后神经功能的恢复，减少功能缺失[16]。

总而言之，如果能将KP从产生QUIN的KMO分支转向生成KYNA的方向，这可能对SCI的治疗提供不可小视的帮助。

随着研究的不断发展，表观遗传学在近年受到人们的广泛关注和青睐。

KP和SCI的最新研究致力于通过基因调控SCI中KAT-α（一种介导KYNA合成的KP相关酶）的表达，达到促进SCI功能恢复的目的[17]。

这主要得益于KYNA表达增加，能拮抗NMDA受体，从而抑制神经元Ga2+内流和 nNOS活化等一系列神经毒性作用，这同时也会减少KMO途径的活化，降低QUIN的生成。

此外，氯胺酮及其他的NMDA受体拮抗剂能显著改善损伤引起的神经性疼痛[18]。

在一项大鼠研究中发现，在SCI发生7d后，坐骨神经长期受到压迫而引发的神经性疼痛时，IDO2、KMO和3-HAO的mRNA表达显著升高。

反复的使用KMO抑制剂（UPF-648和Ro 61-8048）能减少过敏反应并减少神经性疼痛，其目的也是将KP更多地转向了NMDA受体拮抗剂KYNA 的方向[19, 20]。

但是目前KP用于SCI治疗的研究相对匮乏，大部分研究都集中于KP用于大脑神经退行性变的治疗，因此仍需进一步的实验来弥补KP用于治疗SCI的空白，为最终用于临床打下坚实的实验基础。

5 小结
近年来KP受到人们广泛的关注，在多种疾病中被深入研究，包括重度抑郁、自杀倾向、孤独症、精神分类、帕金森和阿尔茨海默病等，并证实KP在神经退行性疾病中扮演重要角色，这给KP与SCI的研究奠定了良好的实验基础[21-24]。

这些研究阐明的一些现象，也解释了一些问题，同时也留给人们一些思考。

针对KP的研究证实，KMO抑制剂对SCI 的治疗具有重要的价值，它不仅减少了长期炎症引起的病理生理学影响，还缓解患者的情绪，且改善SCI引发的神经性疼痛[20]。

当发现KMO抑制剂能显著改善神经的退行性变，并有助于阿尔茨海默病和亨延顿病的治疗开始，针对KMO抑制剂的研究就层出不穷，KMO被认为是比IDO-1更好的治疗靶向，因为抑制KMO不仅减少具有神经毒性作用的QUIN表达，且能增加具有神经保护作用的KYNA 表达。

但是同时也观察到，KMO抑制剂并不能减少脑内QUIN的表达，但是能增加周围KYNA的表达并穿过血脑屏障引起脑内KYNA增高。

最新的KMO抑制剂（CHDI-340246和UPF-648）也不能很好地作用于CNS，主要原因在于药物难以穿透血脑屏障[20, 25]。

因此，发现一种具有良好血脑屏障渗透性的KMO抑制剂，以帮助减少CNS QUIN的分泌并增加KYNA，对神经功能的保护和修复具有重要的意义。

在这种情况下，Jacobs等[26]已经致力于新型KMO抑制剂的探索，他们尝试利用高通量筛选，致力于发现具有良好CNS渗透性的结构，并最终应用到SCI的治疗中去。

目前以KP作为治疗靶向用于治疗SCI的研究尚浅，进一步的探索两者之内的关系对提高SCI的治疗具有重要的意义。

参 考 文 献
[1] Jacobs KR, Lovejoy DB. Inhibiting the kynurenine pathway
in spinal cord injury: Multiple therapeutic potentials? Neural Regen Res, 2018, 13(12): 2073-2076.
钟佳师等.犬尿氨酸信号通路的组成成分及对脊髓继发性损伤的影响
第6期 551
[2] De Oliveira FR, Fantucci M Z, Adriano L, et al. Neurological
and Inflammatory Manifestations in Sjögren’s Syndrome: The Role of the Kynurenine Metabolic Pathway. Int J Mol Sci, 2018, 19(3953): 1-29
[3] Jacobs KR, Castellano-Gonzalez G, Guillemin GJ, et al.
Major Developments in the Design of Inhibitors along the Kynurenine Pathway. Curr Med Chem, 2017, 24(23): 2471-2495.
[4] Castellano-Gonzalez G, Jacobs K R, Don E, et al. Ky-
nurenine 3-Monooxygenase Activity in Human Primary Neurons and Effect on Cellular Bioenergetics Identifies New Neurotoxic Mechanisms. Neurotox Res, 2019, 1007(10): 1-12.
[5] Fujigaki H, Mouri A, Yamamoto Y, et al. Linking phency-
clidine intoxication to the tryptophan-kynurenine pathway: Therapeutic implications for schizophrenia. Neurochem Int, 2019, 125(5): 1-6.
[6] Sas K, Szabó E, Vécsei L. Mitochondria, Oxidative Stress
and the Kynurenine System, with a Focus on Ageing and Neuroprotection. Molecules, 2018, 23(1): 191.
[7] Badawy AA. Hypothesis kynurenic and quinolinic acids:
The main players of the kynurenine pathway and opponents in inflammatory disease. Med Hypotheses, 2018, 118(1): 129-138.
[8] Gensel JC, Zhang B. Macrophage activation and its role
in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res, 2015, 1619(14): 1.
[9] Braidy N, Grant R. Kynurenine pathway metabolism and
neuroinflammatory disease. Neural Regen Res, 2017, 12(1): 39-42.
[10] Luo JF, Shen XY, Lio CK, et al. Activation of Nrf2/HO-1
Pathway by Nardochinoid C Inhibits Inflammation and Oxidative Stress in Lipopolysaccharide-Stimulated Macro-phages. Front Pharmacol, 2018, 9(1): 911.
[11] Xia P, Gao X, Duan L, et al. Mulberrin (Mul) reduces spinal
cord injury (SCI)-induced apoptosis, inflammation and ox-idative stress in rats via miroRNA-337 by targeting Nrf-2.
Biomed Pharmacother, 2018, 107: 1480-1487.
[12] Colín-González AL, Luna-López A, Königsberg M, et al.
Early modulation of the transcription factor Nrf2 in rodent striatal slices by quinolinic acid, a toxic metabolite of the kynurenine pathway. Neuroscience, 2014, 1589: 1-14. [13] Blight AR, Cohen TI, Saito K, et al. Quinolinic acid accumu-
lation and functional deficits following experimental spinal cord injury. Brain, 1995, 118( Pt 3): 35-752.
[14] Yates JR, Heyes MP, Blight AR. 4-chloro-3-hydroxyan-
thranilate reduces local quinolinic acid synthesis, improves functional recovery, and preserves white matter after spinal
cord injury. J Neurotrauma, 2006, 23(6): 866-881. [15] Yates JR, Gay EA, Heyes MP, et al. Effects of methyl-
prednisolone and 4-chloro-3-hydroxyanthranilic acid in experimental spinal cord injury in the guinea pig appear to be mediated by different and potentially complementary mechanisms. Spinal Cord, 2014, 52(9): 662-666.
[16] Zarnowski T, Tulidowicz-Bielak M, Zarnowska I, et al. Ky-
nurenic Acid and Neuroprotective Activity of the Ketogenic Diet in the Eye. Curr Med Chem, 2017, 24(32): 3547-3558.
[17] Jia C, Yoshimura N, Liao L. Herpes simplex virus vec-
tor-mediated gene transfer of kynurenine aminotransferase improves detrusor overactivity in spinal cord-injured rats.
Gene Ther, 2014, 21(5): 484-489.
[18] Hagen EM, Rekand T. Management of Neuropathic Pain
Associated with Spinal Cord Injury. Pain Ther, 2015, 4(1): 51-65.
[19] Rojewska E, Piotrowska A, Makuch W, et al. Pharmaco-
logical kynurenine 3-monooxygenase enzyme inhibition significantly reduces neuropathic pain in a rat model. Neuro-pharmacology, 2016, 102: 80-91.
[20] Rojewska E, Ciapała K, Piotrowska A, et al. Pharmaco-
logical Inhibition of Indoleamine 2,3-Dioxygenase-2 and Kynurenine 3-Monooxygenase, Enzymes of the Kynurenine Pathway, Significantly Diminishes Neuropathic Pain in a Rat Model. Front Pharmacol, 2018, 9(724): 1-13.
[21] Lim CK, Essa MM, de Paula Martins R, et al. Altered ky-
nurenine pathway metabolism in autism：Implication for immune-induced glutamatergic activity. Autism Res, 2016, 9(6): 621-631.
[22] Bryleva EY, Brundin L. Kynurenine pathway metabolites
and suicidality. Neuropharmacology, 2017, 112(Pt B): 324-330.
[23] Plitman E, Iwata Y, Caravaggio F, et al. Kynurenic Acid in
Schizophrenia：A Systematic Review and Meta-analysis.
Schizophr Bull, 2017, 43(4): 764-777.
[24] Oxenkrug G, van der Hart M, Roeser J, et al. Peripheral
Tryptophan - Kynurenine Metabolism Associated with Met-abolic Syndrome is Different in Parkinson’s and Alzheimer’s Diseases. Endocrinol Diabetes Metab J, 2017, 1(4): 1-10. [25] Beaumont V, Mrzljak L, Dijkman U, et al. The novel KMO
inhibitor CHDI-340246 leads to a restoration of electro-physiological alterations in mouse models of Huntington’s disease. Exp Neurol, 2016, 282(5): 99-118.
[26] Jacobs KR, Guillemin GJ, Lovejoy DB. Development of
a Rapid Fluorescence-Based High-Throughput Screening
Assay to Identify Novel Kynurenine 3-Monooxygenase In-hibitor Scaffolds. SLAS Discov, 2018, 23(6): 554-560.。