大建中汤通过调节P2X7R介导胶质细胞活化减轻大鼠肠易激综合征内脏痛

大建中汤通过调节P2X7R 介导胶质细胞活化
减轻大鼠肠易激综合征内脏痛*
武
静1， 田维毅1， 蔡
琨1， 李尧锋1， 杨莎莎2△
（1贵州中医药大学基础医学院，贵州 贵阳 550025；2贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550001）［摘
要］ 目的：研究肠易激综合征（irritable bowel syndrome ， IBS ）内脏痛大鼠脊髓后角（posterior horn of spi‑
nal cord ， PHSC ）和前扣带回皮质（anterior cingulate cortex ， ACC ）星形胶质细胞中胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fi‑brillary acidic protein ， GFAP ）及P2X7受体（P2X7 receptor ， P2X7R ）表达的变化及大建中汤（Dajianzhongtang ， DJZT ）的干预作用。

方法：通过腹腔注射卵清白蛋白、母婴分离、乙酸灌肠等方式制备IBS 内脏痛大鼠模型，将模型大鼠随机分为3组：模型组（灌服等体积生理盐水，每天1次，持续2周）、DJZT 组（10.8 g/kg DJZT 灌胃，每天1次，持续2周）和P2X7R 拮抗剂亮蓝G （brilliant blue G ， BBG ）组（腹腔注射50 mg/kg ，每天1次，持续2周），另设正常组（灌服等
体积生理盐水，每天1次，持续2周），共计4组，每组10只。

采用腹部撤离反射（abdominal withdrawal reflex ， AWR ）评估各组大鼠内脏疼痛敏感度；苏木精-伊红（hematoxylin -eosin ， HE ）染色观察大鼠结肠黏膜的病理变化；RT -qPCR 和Western blot 检测大鼠PHSC 和ACC 组织中脑源性神经营养因子（brain -derived neurotrophic factor ， BDNF ）、白细胞介素1β（interleukin -1β， IL -1β）、GFAP 和P2X7R 的mRNA 及蛋白表达水平；免疫荧光双染法观察PHSC 和ACC 组织中GFAP 和P2X7R 的定位情况。

结果：与正常组大鼠比较，模型组大鼠AWR 评分于60、40和20 mmHg 压力下增加（P <0.01），结肠组织HE 染色病变均未见病理改变，PHSC 和ACC 组织中BDNF 、IL -1β、GFAP 和P2X7R 的mRNA 及蛋白表达水平显著升高（P <0.01）；PHSC 和ACC 组织中GFAP 与P2X7R 共表达，且模型组PHSC 和ACC 组织中GFAP 和P2X7R 共表达阳性细胞数量显著增多（P <0.01）。

与模型组相比，BBG 组和DJZT 组AWR 评分于60、40和20 mmHg 压力下下降（P <0.01），ACC 和PHSC 组织中IL -1β、BDNF 、GFAP 和P2X7R 的mRNA 及蛋白表达水平显著降低（P <0.01）；BBG 组大鼠PHSC 和ACC 组织中GFAP 和P2X7R 共表达阳性细胞数量显著减少（P <0.01）。

DJZT 组和BBG 组上述各指标的差异均无统计学意义。

结论：DJZT 减轻大鼠IBS 内脏痛的机制可能与其调节PHSC 和ACC 组织中P2X7R 和GFAP 的表达有关。

［关键词］ 大建中汤；肠易激综合征；内脏痛；胶质细胞原纤维酸性蛋白；P2X7受体；星形胶质细胞［中图分类号］ R285； R363 ［文献标志码］ A
doi ： 10.3969/j.issn.1000-4718.2023.06.015
Dajianzhongtang attenuates visceral pain in rats with irritable bowel syn⁃
drome by regulating P2X7R -mediated glial cell activation
WU jing 1， TIAN Weiyi 1， CAI Kun 1， LI Yaofeng 1， YANG Shasha 2△
（1School of Basic Medicine ， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine ， Guiyang 550025， China ； 2The First Affi⁃liated Hospital ， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine ， Guiyang 550001， China. E -mail ： yangyuansha 88@ ）
［ABSTRACT ］ AIM ： To explore the mechanism of Dajianzhongtang （DJZT ） in treating visceral pain in rats with
irritable bowel syndrome （IBS ）. METHODS ： The IBS visceral pain rat model was prepared by intraperitoneal injection
of oval albumin ， mother -infant separation ， acetic acid gavage ， etc. The model rats were randomly divided into 3 groups ： model group （instillation of equal volume of normal saline ， once a day for 2 weeks ）， DJZT group （gavage of 10.8 g/kg DJZT ， once a day for 2 weeks ） and P2X7 receptor （P2X7R ） antagonist brilliant blue G （BBG ） group （intraperitoneal in‑jection of 50 mg/kg BBG ， once a day for 2 weeks ）. Another control group （gavage of equal volume of normal saline ， once ［文章编号］ 1000-4718（2023）06-1077-09
［收稿日期］ 2022-11-09 ［修回日期］ 2023-03-31
* ［基金项目］ 国家自然科学基金项目（No. 82260855； No. 81960821）；贵州省基础研究计划（自然科学）项目（黔科合基础-ZK 〔2022〕一般495号）；贵州省卫生健康委科学技术基金项目（No. gzwkj2023-503）
△通讯作者 Tel ：182****8233； E -mail ： yangyuansha88@
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a day for 2 weeks） was set up. There were a total of 4 groups， with 10 rats in each group. The abdominal withdrawal reflex （AWR） was used to assess the visceral pain sensitivity of each group of rats. Hematoxylin-eosin （HE） staining was used to observe the pathological changes in the colonic mucosa of rats. The mRNA and protein expression levels of brain-derived neurotrophic factor （BDNF）， interleukin-1β （IL-1β）， glial fibrillary acidic protein （GFAP） and P2X7 receptor （P2X7R）in posterior horn of spinal cord （PHSC）and anterior cingulate cortex （ACC）tissues were measured by RT-qPCR and Western blot. The localization of GFAP and P2X7R in PHSC and ACC tissues was observed by immunofluorescence dou‑ble-staining.RESULTS：Compared with control group，AWR scores of the rats in model group were significantly in‑creased at 60， 40 and 20 mmHg pressure （P<0.01）. No significant pathological changes were seen in HE-stained lesions of colonic tissues.The mRNA and protein expression levels of BDNF，IL-1β，GFAP and P2X7R were significantly in‑creased in PHSC and ACC tissues （P<0.01）. The GFAP and P2X7R were co-expressed in PHSC and ACC tissues， and the number of GFAP and P2X7R co-expressing positive cells increased in PHSC and ACC tissaes （P<0.01）. Compared with model group， AWR scores of the rats in BBG and DJZT groups significantly decreased at 60， 40 and 20 mmHg pres‑sure （P<0.01）， and the IL-1β， BDNF， GFAP and P2X7R mRNA and protein expression levels in ACC and PHSC tissues significantly decreased （P<0.01）. The number of GFAP and P2X7R co-expressing positive cells in PHSC and ACC tis‑sues of the rats in BBG group decreased （P<0.01）. For each of the above indexes， there was no statistical significance be‑tween DJZT group and BBG group.CONCLUSION： The mechanism by which DJZT alleviates visceral pain in IBS rats may be related to its regulation of P2X7R and GFAP expression in PHSC and ACC tissues.
［KEY WORDS］Dajianzhongtang； irritable bowel syndrome； visceral pain； glial fibrillary acidic protein； P2X7 receptor； astrocytes
肠易激综合征（irritable bowel symdrome， IBS）作为多发的慢性功能性疾病，内脏高敏感是其主要病理生理机制，临床上的典型表现为反复发作的慢性腹痛（内脏痛）、腹泻，多伴有抑郁焦虑症状［1］。

祖国医学根据IBS的腹痛、腹泻、怕冷等临床症状，将其归属为“腹痛”、“泄泻”等中医病名范畴，认为脾胃为
IBS病位，病因为感寒、气滞、虫积、血凝等，脾胃虚寒为其内在病机。

因而，脾阳虚证是IBS内脏痛的主要辨证类型［2］，这与大建中汤（Dajianzhongtang， DJZT）主治的脾阳虚腹痛、腹泻、畏寒症状相一致。

DJZT 具有逐寒镇痛之功，与《内经》“寒气入经而稽迟，泣而不行”的理论相契合，是治疗中阳虚衰寒邪内生的典型方药。

本课题组前期研究表明，DJZT通过调节星形胶质细胞的活化抑制大鼠慢性腹痛症状［3］，有学者证实P2X7受体（P2X7 receptor， P2X7R）与慢性疼痛关系密切［4］；而脑源性神经营养因子（brain-de‑rived neurotrophic factor，BDNF）和白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）不仅在疼痛中发挥重要作用，而且还是胶质细胞与神经元之间信号交流中的两个重要伤害性介质。

因此，我们将在大鼠慢性内脏痛中发挥重要作用的脊髓后角（posterior horn of spinal cord， PHSC）和前扣带回皮质（anterior cingu‑late cortex， ACC）［5-6］作为本实验的靶点，通过建立IBS内脏痛大鼠模型，研究脊髓后角和前扣带回皮质中胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）和P2X7R表达的变化及对BDNF和IL-1β的影响，同时探讨DJZT对上述指标的干预作用，进一步探讨该经典方剂治疗大鼠慢性内脏痛的作用机理。

材料和方法
1　动物
6周龄SPF级SD大鼠，雌性16只，雄性8只，体质量为180~200 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号为SCXK（湘）2014-0011，饲养于贵州中医药大学实验动物研究所。

正常饮食1周，然后按雌雄鼠2∶1的比例分笼喂养，雌鼠怀孕后再分开喂养。

待乳鼠出生后选取40只用于实验。

2　药物
DJZT用干姜、蜀椒和人参（贵州中医药大学第一附属医院提供）按2∶1∶1比例制成1.5 g/mL剂量浓度的水浸液，4 ℃保存。

用0.9%生理盐水配制成1 g/L水溶液，4 ℃保存。

3　主要试剂与仪器
抗GFAP小鼠单克隆抗体（批号：ab4648）和抗重组BDNF抗体（批号：ab9794）购自Abcam；抗P2X7R 兔多克隆抗体（批号：GXP372383）和抗GAPDH兔多克隆抗体（批号：GXP199629）购自GenXspan；抗IL-1β鼠单克隆抗体（批号：12242S）购自Cell Signaling Technology；罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG（批号：ZF-0313）和荧光封片剂（含DAPI；批号：ZLI-9557）购自北京中杉金桥生物有限公司；FITC标记的山羊抗兔
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IgG （批号：GB22303）购自Servicebio ；生物素化山羊抗兔IgG （H+L ）（批号：ab6721）购自Thermo Fisher ；PVDF 膜（Hybond ）；生物素标记Marker （批号：26617）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号：P0012）和ECL 发光试剂盒（KF001）购自Affinity ；PAGE 凝胶快速制备试剂盒（批号：PG112）购自上海雅酶生物科技有限公司；RT PCR EasyTM II （货号：RT -01023）、Ani‑mal Total RNA lsolation Kit （货号：RE -03014）和Real Time PCR EasyTM （货号：QP -01014）购自FORE‑GENE ；亮蓝G （brilliant blue G ， BBG ）购自Cayman Chemical 。

P250 FLASH 荧光扫描显微镜显微镜（济南丹吉尔电子有限公司）；半自动冰冻切片机（沈阳市龙首电子仪器公司）；高通量垂直电泳仪DYCZ -20H 型（北京六一生物科技有限公司）；Image -Pro Plus 6.0图像分析软件（Media Cybernetics ）；V -GES 型电泳槽（艾测电子科技有限公司）；Biorad ChemiDoc XRS+型化学发光凝胶成像仪（广州光仪生物科技有限公司）；Varioskan LUX 多功能酶标仪（微孔板检测仪）（山东莱恩德智能科技有限公司）；JIDI -20R 台式离心机（广州吉迪仪器有限公司）；TY -PCR3型荧光定量PCR 检测仪（山东天研仪器公司）。

4　主要方法
4.1　动物分组及给药　将造模成功的大鼠分为模型（model ）组、DJZT 组和BBG 组，另设正常（control ）组，共计4组，每组10只。

DJZT 组：给予大鼠10.8 g/kg DJZT 灌胃［7］，每天1次，持续2周；BBG 组：给予大鼠50 mg/kg BBG 腹腔注射［8］，每天1次，持续2周；模型组与正常组使用相同剂量0.9%生理盐水灌胃，每天1次，持续2周。

治疗结束后，进行腹部撤离反射（abdominal withdrawal reflex ， AWR ）评分检测。

采用100 mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠致死，收集大鼠脊髓背角、脑和结肠组织，保存备用。

4.2　模型制备［9］　在出生2 d 后，乳鼠母婴每天分
离3 h 不进行哺乳，而正常组则是在笼子里正常喂养；在第8~21天，添加0.5%的乙酸进行刺激，每日1次，每次0.2 mL ，向正常组直肠注射生理盐水0.2 mL 进行对照；第22~41天为正常饲养；然后在42 d 和46 d 腹腔内分别注入30 g/L 的卵清蛋白1 mL ，而在正常组中注入等量的生理盐水；常规饲养到57 d 。

第58天用AWR 检测各组内脏敏感度。

4.3　AWR 检测　为观察大鼠肠道对各压力的敏感度，实验时分别给予各组大鼠肠道内80、60、40和20 mmHg 压力。

每次扩张25 s ，每一次压力进行4次，
平均间隔6 min ，并取平均值。

AWR 的得分参考Al -chaer 等［10］的方法：4分，腹部高离地，使得腹部呈弓状；3分，腹背肌肉收缩的基础上出现腹部上提离开地面；2分，腹背部肌肉轻微收缩；1分，偶有扭动头部；0分，大鼠情绪稳定。

4.4　取材　AWR 测试完成后，大鼠进行麻醉、灌注，断头后立即用冰冻方法将大鼠前扣带回皮层和脊髓后角组织及结肠组织分别浸泡于10%的福尔马林溶液，固定、脱水进行后冰冻切片，-20 ℃冰箱保存，备用。

同时，分别将部分脊髓后角和前扣带回皮质组织保存在-80 ℃冰箱，备用。

4.5　苏木精-伊红（hematoxylin -eosin ， HE ）染色　结肠组织按病理检验SOP 程序进行。

组织封片图像采集，为选择要观察的封片病变区域，先在40倍下观察封片大体病变，再使用100倍和400倍镜头采集图片。

4.6　RT -qPCR 检测BDNF 、IL -1β、GFAP 和P2X7R 的mRNA 表达　采用Trizol 法提取总RNA ，测定RNA 的纯度和浓度，将RNA 反转录为cDNA ，再以cDNA 为模板，扩增合成目的片段。

BDNF 、IL -1β、GFAP 、P2X7R 和内参照β-actin 的引物序列见表1。

使用Thermo Scientific PikoReal 软件分析PCR 过程各检测样本的循环阈值（cycle threshold ， Ct ）。

采用2−ΔΔCt 法来统计相应基因的相对表达情况。

4.7　Western blot 检测BDNF 、IL -1β、GFAP 和P2X7R 的蛋白水平　分别将脊髓后角和前扣带回皮质组织
裂解，将其切成碎片均匀浆液，经4 ℃、1 117.9×g 离心处理，12 min 后将其分离出来；采用BCA 法对蛋白
表1　RT -qPCR 引物序列
Table 1.　The sequences of the primers for RT -qPCR
Name
β-actin BDNF IL -1β
GFAP P2X7R
Forward primer （5′-3′）
GAAGATCAAGATCATTGCTCCT
CGTGATCGAAGAGCTGCTGGATGAGG CGACAAGAGCTTCAGGAAGGCAGTG ACAGCAACAGGGTGGTGGAC TCGGTTTGGCCACCGTGTGT
Reverse primer （5′-3′）
TACTCCTGCTTGCTGATCCA
GCCGCTGTGACCCACTCGCTAATAC TGGGTCAGACAGCACGAGGCATTT TTTGAGGGTGCAGCGAACTT CATTCATGCACAGGGCTCGCA
Product （bp ）
135156126165158
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进行定量，过程如下：经SDS -PAGE 分离、转膜、封闭后，将PVDF 膜中加入适量封闭液，添加Ⅰ抗（GFAP 抗体，1∶500；P2X7R 抗体，1∶500；BDNF 抗体，1∶800；IL -1β抗体，1∶1 000；GAPDH 抗体，1∶5 000），4 ℃下过夜，洗涤后加入Ⅱ抗（1∶5 000），于室温下孵育2 h ，并使用ECL 发光液孵育后显影。

4.8　免疫荧光法观察GFAP 和P2X7R 的定位　将前额叶组织切片取出，在室温下用1％胎牛血清封闭切片1 h ；然后加入Ⅰ抗将其置于4 ℃的湿箱内，过夜。

用PBS 清洗3遍，添加生物素化Ⅱ抗，37 ℃避光培养1 h ，与DAPI 同室温染色30 min ，用PBS 清洗3次，用抗荧光衰减封片剂封口。

先将各切片置于100倍下观察，再在400倍下分别取3幅显微影像，用Image -Pro Plus 6.0软件进行分析。

5　统计学处理
采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，所有数值均用均数±标准差（mean±SD ）表示。

多样本间比较采用单因素方差分析）；如样本资料不符合方差分析的条件，则采用完全随机设计的秩和检验（Kruskal -Wallis ）。

以P <0.05为差异有统计学意义。

结
果
1　各组大鼠AWR 评分比较
与正常组大鼠相比，模型大鼠组AWR 分数于
20、40和60 mmHg 3个压力下升高（P <0.01），表明内脏痛模型成功；与模型组大鼠比较，DJZT 组各压力下AWR 评分降低（P <0.01），证明DJZT 能够降低模
型大鼠内脏高敏状态，见表2。

2　各组大鼠结肠组织病理观察结果
每组大鼠结肠组织进行HE 检测，正常组、模型组、DJZT 组和BBG 组结肠组织均未见病理改变，4组大鼠结肠黏膜表面被覆单层柱状上皮，核仁完整，核呈椭圆形或圆形，无坏死、变性或脱落；黏膜肌层与
固有层结构清楚，同时固有层大肠腺排列较为紧密，杯细胞数目正常，固有层内散在有少量中性粒细胞、淋巴细胞与嗜酸性粒细胞等分布；黏膜下层完整，含丰富的血管；肌层肌纤维内环外纵双层排列，结构完整清晰，无变性或坏死；浆膜层完整，由薄层结缔组织及间皮细胞构成，见图1。

3　各组大鼠PHSC 和ACC 组织中GFAP 和P2X7R 的表达情况
与正常组相比，模型组大鼠PHSC 组织中GFAP 和P2X7R 的mRNA 及蛋白表达水平显著升高（P <0.01），ACC 组织中GFAP 和P2X7R 的mRNA 及蛋白表达水平同样升高（P <0.01）；与模型组相比，BBG 组和DJZT 组GFAP 和P2X7R 的mRNA 及蛋白表达水平显著降低（P <0.01）；BBG 组与DJZT 组之间相比，上述指标无显著差异，见表3和图2。

4　各组大鼠PHSC 和ACC 组织中BDNF 和IL -1β
的表达情况
与正常组相比，模型组大鼠PHSC 和ACC 组织中BDNF 和IL -1β的mRNA 及蛋白表达增加（P<0.01）；与模型组相比，BBG 组和DJZT 组BDNF 和IL -
1βmRNA 及蛋白表达下降（P <0.01）；BBG 组与DJZT 组比较无差异，
见表4和图3。

5　免疫荧光双染法观察PHSC 和ACC 组织中GFAP 和P2X7R 的共表达情况
免疫荧光染色结果显示，在PHSC 和ACC 组织中，红色表示GFAP ，绿色表示P2X7R ，蓝色表示细胞核，P2X7R 与星形胶质细胞的标志蛋白GFAP 共表达。

与正常组相比，模型组大鼠PHSC 和ACC 组织
中P2X7R 与GFAP 共表达阳性细胞数量均显著增多（P <0.01）；与模型组相比，BBG 组大鼠PHSC 和ACC 组织中P2X7R 与GFAP 共表达阳性细胞数量均显著减少（P <0.01）。

见图4。

讨论
近年来，人们对IBS 内脏痛的认识越来越深入，神经-免疫-内分泌网络失调已经逐渐成为研究热点［11-12］，但其机制仍不清楚。

祖国医学治疗慢性内脏痛有很好的疗效，中药DJZT 由我国汉代医圣张仲景
表2　各组大鼠AWR 评分情况
Table 2.　The AWR scores of the rats in each group （Mean±SD. n =10）Group
Control Model DJZT BBG
20 mmHg
0.61±0.521.68±0.93**0.72±0.46##0.66±0.44##
40 mmHg
1.27±0.43
2.66±0.88**1.53±0.46##1.36±0.64##
60 mmHg
2.26±0.87
3.68±0.48**2.57±0.62##
2.36±0.49##
80 mmHg
3.24±0.423.26±0.513.39±0.433.25±0.47
**
P <0.01 vs control group ； ##P <0.01 vs model group.
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表3　各组大鼠PHSC 和ACC 组织中GFAP 和P2X7R 的mRNA 表达情况
Table 3.　The mRNA expression of GFAP and P2X7R in PHSC and ACC tissues of the rats in each group （Mean±SD. n =10）
Group
Control Model DJZT BBG GFAP （PHSC ）0.98±0.171.90±0.33**1.23±0.36##1.20±0.40##
GFAP （ACC ）1.13±0.312.32±0.97**1.41±0.72##1.34±0.48##
P2X7R （PHSC ）1.04±0.191.93±0.46**1.31±0.39##
1.21±0.41##
P2X7R （ACC ）1.20±0.392.07±0.78**1.57±0.89##1.30±0.50##
**
P <0.01 vs control group ； ##P <0.01 vs
model group.
Figure 1.　Histomorphological changes of colonic mucosa （HE staining ， scale bar=50 μm ）. A ： control group ； B ： model group ； C ： DJZT group ； D ： BBG group. There was no obvious pathological change in colonic tissues of the rats.
图 1　各组大鼠结肠组织HE
染色情况
Figure 2.　Western blot was used to detect the expression of GFAP and P2X7R in ACC and PHSC tissues of the rats. A ： the expres‑
sion of GFAP and P2X7R in PHSC tissues of the rats ； B ： the expression of GFAP and P2X7R in ACC tissues of the rats.
Mean±SD. n =10. **P <0.01 vs control group ； ##P <0.01 vs model group ．
图2　Western blot 检测大鼠PHSC 和ACC 组织中GFAP 和P2X7R 的蛋白表达水平
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创立，其以“药少力专”的特点被历代医家推崇为治疗腹痛的经典方剂。

现代研究证明，DJZT治疗各种急、慢性腹部疼痛有较好效果［13］。

本次研究证实，
IBS内脏疼痛大鼠在60、40和20 mmHg压力下，肠道AWR分数均增高，说明大鼠肠道通过长期的刺激，可引起肠内慢性疼痛，并使大鼠痛觉敏化，疼痛反应显著；BBG组与DJZT组AWR分数在60、40和20 mmHg压力下有下降趋势。

结果显示，BBG和DJZT 均能减轻模型大鼠的慢性内脏痛，并能使模型大鼠疼痛得到减轻。

过去一直认为星形胶质细胞在大脑中具有引导、支持与分隔神经细胞，并对神经细胞起到保护作用，但近年来研究证实，在神经元发挥功能时星型胶质细胞起着重要调节作用［14-16］。

在中枢神经系统，P2X7R可以表达于星形胶质细胞［17］。

P2X7R是配体门控离子型嘌呤能P2X受体的一个亚型，被三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP）激活后通过多种外周及中枢机制参与人体生理机能的调节［18］。

本研究结果显示，IBS内脏痛大鼠PHSC内GFAP和
P2X7R的mRNA及蛋白表达升高，而DJZT组和P2X7R拮抗剂BBG组能够降低模型组大鼠PHSC内GFAP和P2X7R的mRNA及蛋白表达水平，这可能是DJZT减轻大鼠慢性内脏痛的作用机制。

此外，我们采用免疫荧光双染法观察PHSC组织中GFAP和P2X7R的表达，结果显示，GFAP和P2X7R共表达，模型组大鼠GFAP和P2X7R共表达阳性细胞数量升高，P2X7R抑制剂BBG组大鼠PHSC内GFAP和P2X7R共表达下降。

这说明在脊髓后角水平P2X7R 可能介导星型胶质细胞活化，导致大鼠IBS内脏痛。

目前，脑内星型胶质细胞及其膜上P2X7R在慢性内脏痛中的作用还未见报道，在慢性内脏痛条件下他们在大脑ACC内如何发挥作用仍不清楚。

本研究结果表明，IBS内脏痛大鼠ACC内GFAP和P2X7R 的mRNA及蛋白表达升高，而DJZT和P2X7R
拮抗剂Figure 3.　Western blot was used to detect the expression of BDNF and IL-1β in ACC and PHSC tissues of the rats. A： the expression of BDNF and IL-1β in PHSC tissues of the rats； B： the expression of BDNF and IL-1β in ACC tissues of the rats. Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs model group．
图 3　Western blot检测大鼠PHSC和ACC组织中BDNF和IL-1β的蛋白表达水平
表4　各组大鼠PHSC和ACC组织中BDNF和IL-1β的mRNA表达情况
Table 4.　The mRNA expression of BDNF and IL-1β in PHSC and ACC tissues of the rats in each group （Mean±SD.n=10）
Group
Control
Model
DJZT
BBG
BDNF （PHSC）
1.02±0.20
1.88±0.31**
1.21±0.49##
1.12±0.38##
BDNF （ACC）
1.01±0.19
1.69±0.27**
1.17±0.37##
1.16±0.36##
IL-1β （PHSC）
1.02±0.26
1.86±0.56**
1.18±0.38##
1.20±0.41##
IL-1β （ACC）
1.03±0.27
1.99±0.62**
1.26±0.43##
1.19±0.38##
**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs model group.
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Figure 4.　： representative immuno‑
fluorescence double staining images observed by confocal fluorescence microscopy. The expression of GFAP was stained
with GFAP antibody （red ）， the expression of P2X7R was stained with P2X7R antibody （green ）， and nuclei was stained
with DAPI （blue ）. The scale bar=20 μm. C and D ： statistical results of GFAP+P2X7R positive cells in PHSC and ACC tis‑
sues of the rats. Mean±SD. n =10. **P <0.01 vs control group ； ##P <0.01 vs model group ．
图4　GFAP 和P2X7R 在大鼠PHSC 和ACC 组织中的表达情况
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BBG能够降低慢性内脏痛大鼠ACC组织内GFAP和P2X7R的mRNA及蛋白表达水平；本研究结果还表明，GFAP和P2X7R共定位，模型组GFAP和P2X7R 共表达阳性细胞数量上升，P2X7R抑制剂BBG组大鼠ACC组织内GFAP和P2X7R共表达下降，直接证实了在大脑皮质，P2X7R介导星型胶质细胞活化参与了慢性内脏痛的维持。

研究证实，当P2X7R被激活后可以促进细胞外的Ca2+和细胞内钙库的Ca2+进入胞质，随着Ca2+浓度升高导致星形胶质细胞释放BDNF和IL-1β等［19］。

BDNF通过激活NMDA受体参与中枢敏化的启动和维持［20］，BDNF通过酪氨酸激酶受体B（tyrosine ki‑nase receptor B，TrkB）改变神经元的兴奋性增加痛觉过敏［21-22］。

IL-1β是一种典型的多功能促炎细胞因子，在炎性痛、内脏痛和神经病理性疼痛等慢性疼痛中发挥重要作用［23-24］，IL-1β主要通过增加神经元的兴奋性导致中枢痛觉敏化［25-27］。

可见，IL-1β和BDNF是胶质细胞与神经元之间信号交流中的两个重要伤害性介质。

本研究果显示，与正常组大鼠相比，内脏痛大鼠ACC和PHSC组织中的IL-1β与BDNF mRNA及蛋白表达升高；与模型组相比，BBG 组和DJZT组大鼠PHSC和ACC组织中BDNF和IL-1β的mRNA及蛋白表达下降。

我们认为，星形胶质细胞活化后分泌IL-1β和BDNF等因子，一方面能够导致神经元痛觉敏化，同时他们又反过来进一步促进胶质细胞活化，形成恶性循环，导致疼痛的持续存在。

BBG阻断P2X7R后，BDNF和IL-1β表达降低，与DJZT干预后效果一致。

这表明在ACC和PHSC水平上，DJZT通过抑制星形胶质细胞释放BDNF和IL-1β可能是减轻大鼠IBS内脏痛作用机制。

综上所述，我们证实在通过腹腔注射卵清白蛋白、母婴分离及乙酸灌肠等方式制备的IBS内脏痛大鼠模型上，在脊髓和脑水平活化的P2X7R导致星形胶质细胞激活释放大量的疼痛因子BDNF和IL-1β，后者可能通过增加神经元的兴奋性导致中枢痛觉敏化，进而发生大鼠慢性内脏痛。

DJZT能够通过逆转上述病理生理改变，可能是其减轻IBS内脏痛模型大鼠的作用机制。

但P2X7R介导胶质细胞活化是如何与神经元进行对话导致大鼠慢性内脏痛的，还需要深入研究。

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（责任编辑：宋延君，李淑媛）
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