非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

畜牧兽医学报 2023,54(8):3415-3423
A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c a
d o i :10.11843/j
.i s s n .0366-6964.2023.08.026开放科学(资源服务)
标识码(O S I D )
:非洲猪瘟病毒p 30蛋白单克隆抗体
制备及其抗原表位鉴定
刘桃雪1,2,3,苏冰倩1,2,3,齐艳丽1,2,3,郭江涛1,2,3,刘忠虎1,2,3,褚贝贝1,
2,3
,王 江1,2,3*,曾 磊1,
2,3*
(1.河南农业大学动物医学院,郑州450046;2.
河南农业大学,农业农村部动物生化与营养重点实验室,郑州450046;3.河南农业大学,河南省动物生长发育调控重点实验室,郑州450046
)摘 要:为制备非洲猪瘟病毒(A S F V )p
30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p 30蛋白为免疫原免疫6~8周龄雌性B A L B /c 小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与S P 2/0细胞进行融合,通过间接E L I S A 方法筛选㊂结
果获得2株能稳定分泌抗A S F V p 30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2G 10-2和6D 2-1㊂抗体效价分
别为1ʒ12800和1ʒ3200㊂亚型鉴定结果显示,2株单克隆抗体的重链均属于I g
G ,轻链均为κ型㊂W e s t e r n b l o t 和间接免疫荧光试验结果显示,2株单克隆抗体与p 30蛋白均具有良好的结合活性㊂通过W e s t e r n b l o t 检测,2株单
克隆抗体能有效结合截短重组p 30蛋白的170~194位氨基酸,证明其抗原识别区域为第170~194位氨基酸㊂本研究制备了p 30蛋白的2株单克隆抗体,并对其抗原表位进行鉴定,为A S F V p 30蛋白结构和功能的研究及血清
学诊断试剂的研发奠定基础㊂
关键词:非洲猪瘟病毒;p
30蛋白;原核表达;单克隆抗体;抗原表位中图分类号:S 852㊁659.1 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)08-3415-09
收稿日期:2022-10-21
基金项目:河南农业大学青年英才项目;河南省教学改革项目(2021S J G L X 351
)作者简介:刘桃雪(1995-),女,河南商丘人,硕士生,主要从事动物生物化学与分子生物学研究,E -m a i l :1002691439@q q .c o m ;苏冰倩(1994-),女,河南安阳人,博士生,主要从事基础兽医学研究,E -m a i l :1126575812@q q .c o m ㊂刘桃雪和苏冰倩为同等贡献作者*通信作者:王 江,主要从事动物生物化学与分子生物学研究,E -m a i l :w a n g j i a n g
@h e n a u .e d u .c n ;曾 磊,主要从事动物生物化学与分子生物学研究,E -m a i l :z e n g
l e i 2021918@163.c o m P r e p a r a t i o n o f t h e M o n o c l o n a l A n t i b o d y a g
a i n s t t h e A f r i c a n S w i n e F e v e r V i r u s p 30P r o t e i n a n d I d e n t i f i c a t i o n o f t h e A n t i g e n i c E p i t o p
e L I U T a o x u e
1,2,3
,S U B i n g q i a n 1,2,3,Q I Y a n l i 1,2,3,G U O J i a n g t a o 1,2,3
,L I U Z h o n g h u 1,2,3,C HU B e i b e i 1,2,3,WA N G J i a n g
1,2,3*,Z E N G L e i 1,2,3*
(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,H e n a n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,Z h e n g
z h o u 450046,C h i n a ;2.K e y L a b o r a t o r y o f A n i m a l B i o c h e m i s t r y a n d N u t r i t i o n ,H e n a n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e a n d R u r a l A f f a i r s o f t h e P e o p l e 's R e p u b l i c o f C
h i n a ,Z h e n g z h o u 450046,C h i n a ;3.K e y L a b o r a t o r y o f A n i m a l G r o w t h a n d D e v e l o p m e n t o f
H e n a n ,H e n a n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,Z h e n g
z h o u 450046,C h i n a )A b s t r a c t :T h i s s t u d y i s a i m e d t o p r e p a r e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g
a i n s t A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s (A S F V )p 30p r o t e i n .F i v e 6-8w e e k s f e m a l e B A L B /c m i c e w e r e i mm u n i z e d w i t h p r o k a r y
o t i c r e c o m b i n a n t p 30p r o t e i n a s i mm u n o g e n .S p
l e e n c e l l s w e r e i s o l a t e d a n d f u s e d w i t h S P 2/0c e l l s a f t e r 3t i m e s o f i mm u n i z a t i o n .T w o h y
b r i d o m a
c e l l l i n e s ,n a m e
d 2G 10-2a n d 6D 2-1,w h i c h c o u l d
畜牧兽医学报54卷s t a b l y s e c r e t e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t A S F V p30p r o t e i n w e r e o b t a i n e d.T h e a n t i b o d y t i t e r s w e r e1ʒ12800a n d1ʒ3200,r e s p e c t i v e l y.T h e r e s u l t s o f s u b t y p e i d e n t i f i c a t i o n s h o w e d t h a t t h e h e a v y c h a i n o f t h e t w o m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s b e l o n g e d t o I g G,a n d t h e l i g h t c h a i n w a sκt y p e.T h e r e s u l t s o f W e s t e r n b l o t a n d i n d i r e c t i mm u n o f l u o r e s c e n c e a s s a y s h o w e d t h a t b o t h m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s h a d g o o d b i n d i n g a c t i v i t y t o p30p r o t e i n.W e s t e r n b l o t a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e t w o m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s c o u l d e f f e c t i v e l y b i n d t h e170-194a m i n o a c i d s o f t h e r e c o m b i n a n t p30p r o t e i n,w h i c h p r o v e d t h a t t h e a n t i g e n i c r e c o g n i t i o n r e g i o n w a s t h e170-194 a m i n o a c i d s.I n t h i s s t u d y,t w o m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t p30p r o t e i n w e r e p r e p a r e d a n d t h e i r e p i t o p e s w e r e i d e n t i f i e d,w h i c h l a i d a f o u n d a t i o n f o r t h e s t u d y o f t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f A S F V p30p r o t e i n a n d t h e d e v e l o p m e n t o f s e r o l o g i c a l d i a g n o s t i c r e a g e n t s.
K e y w o r d s:A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s;p30;p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n;m o n o c l o n a l a n t i b o d y;
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*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:WA N G J i a n g,E-m a i l:w a n g j i a n g@h e n a u.e d u.c n;Z E N G L e i,E-m a i l: z e n g l e i2021918@163.c o m
非洲猪瘟(A f r i c a n s w i n e f e v e r,A S F)是由非洲猪瘟病毒(A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s,A S F V)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪㊁欧洲野猪等)而引起的一种急性㊁出血性㊁烈性传染病㊂其特征是发病过程短,最急性和急性感染死亡率高达100%㊂非洲猪瘟的爆发,给全球养殖业造成了严重经济损失㊂虽然对非洲猪瘟已进行了广泛的研究,但是仍然缺乏有效的疫苗或抗病毒策略[1],目前主要是采取早期检测㊁严守卫生程序㊁大规模扑杀带毒家畜和野猪等措施将A S F控制在一定区域[2]㊂
A S F V是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员,是具有双层膜结构,直径为200n m的大型双链D N A病毒,呈复杂的二十面体结构,其结构由内到外依次是内核㊁内核心壳㊁内膜㊁衣壳㊁囊膜,基因组全长为170~193k b,中央为保守区,两侧为可变区㊂A S F V基因组庞大且复杂,并具有双层囊膜,所以病毒耐受力强变异度高导致难以形成中和抗体[3]㊂A S F V基因组有150~167个开放阅读框,编码150~200种蛋白质,其中至少有54个结构蛋白[4],主要的结构蛋白有p30㊁p54㊁p72㊁p p220㊁p p62和C D2v蛋白等[5]㊂其中,A S F V的p72㊁p54和p30等结构蛋白均具有良好的抗原性和免疫原性[6-9],具备血清学诊断价值[10-11]㊂
p30蛋白是由C P204L基因编码的重要的内囊膜蛋白,是A S F V的主要结构蛋白之一,也是最具免疫原性的蛋白之一㊂它能够介导A S F V对巨噬细胞的吸附和内化,干扰宿主细胞的转录与翻译,在感染后4h,能在细胞质中检测到[12],然后在整个
感染周期中持续高水平表达,含量丰富且抗原性较高,是重要的病毒早期诊断靶标[13-14]㊂p30的表达表明病毒已经进入细胞并脱壳,病毒基因的早期表达已经开始[15]㊂p30蛋白在非洲猪瘟病毒粒子进入宿主细胞中发挥重要作用,抗p30蛋白的抗体对病毒内化有一定的抑制作用[6],这提示p30蛋白参与A S F V的内化过程,但具体作用机制尚不清楚[7,16]㊂
鉴于p30是早期检测的优良靶标,本研究通过对A S F V p30蛋白氨基酸序列进行原核密码子优化,利用大肠杆菌表达系统获得可溶性重组p30蛋白,将其作为抗原免疫B A L B/c小鼠,制备了2株针对p30蛋白的单克隆抗体,均具有良好的特异性,对其抗原表位进行鉴定,并在预测的三级结构中进行标注㊂为A S F V p30蛋白结构和功能的研究及血清学诊断试剂的研发奠定基础㊂
1材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒㊁菌株N C B I(MK128995.1)中
C h i n a/2018/A n h u i X C G Q-A S F V毒株C P204L基因序列由上海金斯瑞生物科技有限公司进行密码子优化并合成㊂表达菌株B L21(
D E3)感受态细胞购自北京擎科生物科技有限公司㊁克隆菌株T o p10由本实验室制备及保存㊂
1.1.2细胞及毒株骨髓瘤细胞(S P2/0)购自美国A T C C;猪伪狂犬病病毒(P R V)㊁猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S V)㊁猪流行性腹泻病毒
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8期刘桃雪等:非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定
(P E D V)㊁猪圆环病毒(P C V2)㊁猪细小病毒(P P V)㊁猪急性腹泻综合征冠状病毒(S A D S-C o V)为本实验室保存㊂A S F V标准阳性血清购自中国兽医药品监察所㊂
1.1.3动物雌性6~8周龄的B A L B/c小鼠购自郑州大学实验动物中心㊂
1.1.4试剂考马斯亮蓝R-250购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;弗氏佐剂㊁H A T㊁H T 贮存液㊁融合剂P E G1450购自S i g m a公司; N i-N T A A g a r o s e购自Q I A G E N公司;A E C酶底物显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自S i n o B i o l o g i-c a l公司;M i l l i p o r e超滤管购自密理博中国有限公司;透析袋购自V A K E公司(U S A)㊂
1.2方法
1.2.1重组质粒构建及鉴定参考N C B I (MK128995.1)中C h i n a/2018/A n h u i X C G Q-A S-F V毒株C P204L基因序列,运用在线密码子优化工具G e n S m a r t T M C o d o n O p t i m i z a t i o n根据大肠杆菌的密码子偏好性调整p30基因的同义密码子进行密码子优化C P204L全基因㊂表达序列两端引入酶切位点N d eⅠ和H i n dⅢ及6ˑH i s标签,便于基因克隆和蛋白纯化,提交金斯瑞生物科技有限公司合成㊂将重组质粒命名为p E T30a-H i s-p30㊂使用限制性内切酶N d eⅠ和H i n dⅢ对合成的重组质粒p E T30a-H i s-p30进行双酶切鉴定,酶切鉴定正确后将重组质粒送至北京擎科生物科技有限公司进行测序㊂
1.2.2重组p30蛋白诱导表达及可溶性分析
将重组质粒转化至B L21感受态细胞,于37ħ恒温振荡摇床中振荡培养4h,至O D600n m=0.6左右,取1m L菌液作为未诱导对照,然后分别加入0.2㊁0.4㊁0.6㊁0.8和1.0mm o l㊃L-1I P T G,于37ħ及16ħ,180r㊃m i n-1条件下诱导表达10h,以确定诱导p30重组蛋白表达的最佳条件㊂富集菌体,超声波破碎后,4ħ㊁10000r㊃m i n-1离心10m i n分离上清和沉淀㊂S D S-P A G E凝胶电泳后经考马斯亮蓝染色检测蛋白可溶性㊂
1.2.3表达蛋白的纯化及W e s t e r n b l o t鉴定
以最佳诱导条件大量诱导表达p30重组蛋白,参照N i-N T A A g a r o s e操作技术手册对破碎后的上清进行纯化,通过S D S-P A G E电泳,考马斯亮蓝染色鉴定蛋白纯度㊂然后经B C A法测定p30蛋白浓度,将其定量为1m g㊃m L-1后分装保存于-80ħ备用㊂对纯化后的p30蛋白进行W e s t e r n b l o t鉴定,使用按1ʒ1000比例稀释的h i s标签抗体作为一抗, 1ʒ5000比例稀释的H R P标记的兔抗鼠的I g G抗体作为二抗,显色后,进行免疫印迹结果分析㊂
1.2.4动物免疫取5只6~8周龄雌性
B A L B/c小鼠(分别记为鼠1~5),将纯化的重组p30蛋白与弗氏完全佐剂1ʒ1混匀乳化,通过皮下多点注射方式免疫小鼠,免疫剂量为每只50μg㊂二次免疫㊁三次免疫用弗氏不完全佐剂乳化p30蛋白,每次免疫间隔2周,第3次免疫后1周自小鼠尾部采血,分离血清,用间接E L I S A方法测定血清抗体效价;融合前3d选择抗体效价最高的小鼠进行再次免疫,每只腹腔注射100μg重组蛋白㊂
1.2.5杂交瘤细胞融合及筛选再次免疫3d 后将小鼠安乐死,分离脾细胞,在P E G1450作用下将脾细胞与对数生长期的S P2/0细胞按照7ʒ1的比例进行细胞融合㊂融合后将细胞铺至含有H A T选择培养基的96孔细胞板中培养㊂细胞融合7d后,取100μL培养上清用间接E L I S A方法进行检测㊂阳性杂交瘤细胞需进行2~3次亚克隆,直至抗体阳性率达100%㊂将稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株扩大培养并冻存于液氮中长期保存㊂
间接E L I S A方法:将重组p30蛋白用1ˑP B S 稀释至2μg㊃m L-1包被酶标板,4ħ包被过夜,弃去包被液,100μL㊃孔-1P B S T,洗涤3次;用5%脱脂奶于37ħ封闭2h,P B S T洗涤3次;将杂交瘤细胞培养上清作为一抗,加入酶标板,同时设立阴㊁阳性对照,于37ħ反应1h,P B S T洗涤3次;加入100μL H R P标记的山羊抗小鼠I g G(1ʒ2500稀释)于37ħ反应1h,P B S T洗涤3次;每孔加入100μL T M B显色液于37ħ避光显色15m i n;加入100μL2m o l㊃L-1H2S O4终止反应㊂用酶标仪测定每孔O D450n m值,待检样品O D450n m/阴性样品O D450n m(S/N)>2.1判定为阳性㊂
1.2.6腹水制备及纯化选取12周龄雌性
B A L B/c小鼠,向小鼠腹腔内注射300μL弗氏不完全佐剂㊂7d后,向小鼠腹腔中注射3ˑ106~4ˑ106个杂交瘤细胞㊂5~7d后,小鼠的腹部变大,待触之有波动感㊁行动不敏捷㊁被毛粗糙时收集腹水,于4000r㊃m i n-1离心5m i n,取中间层液体㊂用饱和硫酸铵沉淀法对所获得腹水进行纯化,收集纯化后的目标抗体,标记清楚名称等信息并分装后于
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畜牧兽医学报54卷
-80ħ保存㊂
1.2.7单克隆抗体效价测定利用间接E L I S A 以纯化的p30蛋白为抗原,用P B S稀释至100n g㊃m L-1后加入96孔的E L I S A板内,用5%的B S A连续2倍倍比稀释的待检抗体作为一抗,用H R P标记的山羊抗小鼠I g G按照1ʒ5000的比例进行稀释作为二抗,T M B显色15m i n后终止,使用酶标仪,读取各样品孔O D450n m值㊂
1.2.8单克隆抗体亚型鉴定包被亚型抗体:用P B S按比例稀释同型特异性抗体:I g G1 (1ʒ1000)㊁I g G2a(1ʒ2000)㊁I g G2b(1ʒ200)㊁I g G3 (1ʒ500)㊁I g M(1ʒ4000),之后分别加入96孔微孔板内,每个亚型重复3孔;以单克隆细胞培养上清作为一抗,同时设置阳性对照和阴性对照,用H R P标记的山羊抗小鼠I g G按照1ʒ5000的比例进行稀释作为二抗,T M B显色15m i n后终止,读取各样品的O D450n m值,并判定抗体亚型㊂
1.2.9 W e s t e r n b l o t反应性鉴定将p c D N A3-
H A及p c D N A3-p30-H A质粒转染H E K293T细胞,收取细胞内蛋白进行W e s t e r n b l o t验证,用H A 标签抗体按1ʒ1000比例稀释作为一抗,用H R P标记的山羊抗小鼠I g G按照1ʒ5000的比例进行稀释作为二抗,加入显色试剂,显色后,进行免疫印迹结果分析㊂
1.2.10间接免疫荧光试验(I F A)反应性鉴定
取转染p c D N A3-p30-H A质粒24h的H e L a细胞及其玻片(4m L㊃L-1多聚甲醛固定),以单克隆细胞培养上清作为一抗,用H R P标记的山羊抗小鼠I g G 按照1ʒ200的比例进行稀释作为二抗,并对细胞核进行染色,固定玻片后,将玻片置于在荧光显微镜下观察,使用E V O S F L细胞成像系统拍摄照片并保存㊂
1.2.11单克隆抗体抗原表位鉴定利用N e t-S u r f P V e r.1.1(h t t p:ʊg p s.b i o c u c k o o.c n/o n l i n e_ f u l l.p h p)预测p30二级结构,对C P204L基因进行逐步截短(避开α螺旋和β折叠),连接至p G E X4T-3载体,将构建成功的截短质粒转化至B L21感受态,用I P T G诱导表达后,取1m L菌液,99ħ变性10m i n,制作蛋白样品㊂以纯化抗体作为一抗,进行W e s t e r n b l o t反应性鉴定,以确定其抗原表位区域㊂然后使用I-T A S S E R(h t t p s:ʊz h a n g g r o u p.o r g/I-T A S S E R/)在线预测A S F V p30蛋白三级结构,在P y MO L软件中标注出p30单克隆抗体所识别抗原
表位区域㊂
2结果
2.1密码子优化
密码子优化后,与原始序列比对发现碱基序列发生改变(以浅色字体表示,图1A),编码的氨基酸类型并未发生改变(图1B),所表达的p30蛋白的类型也未发生变化㊂
2.2重组p30蛋白诱导表达及可溶性分析
为了诱导重组p30蛋白表达及摸索其最适表达条件,将合成的原核表达质粒p E T30a-H i s-p30转入原核表达菌株B L21(D E3)中,分别采用不同浓度的I P T G和温度诱导蛋白表达,发现在30k u处出现目的蛋白,且I P T G浓度为0.4~0.6mm o l㊃L-1,温度为16ħ,10h诱导效果最佳(图2A㊁2B)㊂S D S-P A G E电泳分析其表达产物有少量以可溶性形式存在于上清中(图2C)㊂
2.3原核表达蛋白的纯化及W e s t e r n b l o t鉴定
为了进一步从上清中纯化重组蛋白p30,将未诱导全菌液㊁诱导全菌液㊁破碎后上清㊁破碎后沉淀㊁收集的流穿液㊁不同咪唑浓度的洗杂缓冲液及洗脱液进行蛋白制样,S D S-P A G E检测样品中蛋白纯化效果,结果发现,在100和250mm o l㊃L-1咪唑洗脱液样品中存在洗脱的目的蛋白p30,大小为30k u,且条带单一(图3A)㊂为了验证纯化后的目的蛋白,对表达产物进行W e s t e r n b l o t验证,一抗为鼠源的H i s标签抗体,二抗为H R P标记的山羊抗鼠的I g G 抗体,结果显示目的蛋白可与H i s标签一抗结合良好,条带与预期大小30k u一致(图3B),说明蛋白成功表达㊂
2.4单克隆抗体W e s t e r n b l o t及I F A反应性鉴定
为了鉴定获得的2株A S F V p30蛋白的单抗与真核表达p30蛋白是否具有良好的结合活性,将p c D N A3-H A及p c D N A3-p30-H A质粒转染H E K293T细胞,收取细胞内蛋白进行W e s t e r n b l o t验证,一抗为a n t i-HA和2G10-2㊁6D2-1,二抗为H R P标记的山羊抗鼠的I g G抗体,结果显示目的蛋白p c D N A3-p30-HA成功表达,获得的2株p30单克隆抗体均能与p30蛋白发生特异性反应,蛋白质大小约为30k u(图4A)㊂其次,I F A结果显示,2株单克隆抗体均与细胞内A S F V p30瞬时表达产物结合良好,在显微镜下可见绿色荧光,定位于细胞质中,空载体转染孔对照无荧光呈现(图4B)㊂
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8期
刘桃雪等:非洲猪瘟病毒p 30蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定
A. O p t i m i z e d 为p 30基因密码子优化后序列, O r i g i n a l 为p 30基因原始序列,优化后碱基标记为浅色;B . O p
t i m i z e d 为密码子优化后p 30蛋白的氨基酸序列, O r i g
i n a l 为原始p 30蛋白氨基酸序列A."O p t i m i z e d "i s t h e o p t i m i z e d c o d o n s e q u e n c e o f t h e p 30g e n e ,"O r i g i n a l "i s t h e o r i g i n a l s e q
u e n c e o f t h e p 30g e n e ,a n d t h e o p t i m i z e d b a s e m a r k e r i s l i g h t c o l o r e d ;B .'O p t i m i z e d 'i s t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f t h e p 30p r o t e i n a f t e r c o d o n o p
t i m i z a -t i o n ,a n d 'O r i g i n a l 'i s t h e o r i g i n a l p 30p r o t e i n a m i n o a c i d s e q u e n c e 图1 p 30基因优化前后序列比对F i g .1 S e q u e n c e a l i g n m e n t a f t e r p 30g e n e o p
t i m i z a t i o
n A.37ħ诱导10h 重组蛋白表达情况;B .16ħ诱导10h 重组蛋白表达情况;C .重组p 30蛋白可溶性分析㊂M.蛋白质相对分子质量;1.p E T 30a -C P 204L 未诱导全菌液;2.p E T 30a -C P 204L 诱导全菌液;3.p E T 30a -C P 204L 诱导上清;4.
p
E T 28a -C P 204L 诱导沉淀A.I n d u c t i o n o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n e x p r e s s i o n a t 37ħf o r 10h o u r s ;B .I n d u c t i o n o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n e x p
r e s s i o n a t 16ħf o r 10h o u r s ;C .S o l u b i l i t y a n a l y s i s o f r e c o m b i n a n t p 30p r o t e i n .M.P r o t e i n m a r k e r ;1.U n i n d u c e d a l l b a c t e r i a l i q
u i d o f p E T 30a -C P 204L ;2.I n d u c e d a l l b a c t e r i a l i q u i d o f p E T 30a -C P 204L p r e c i p i t a t i o n ;3.I n d u c e d s u p
e r n a t a n t o
f p E T 30a -C P 204L ;4.I n d u c e d p r e c i p i t a t i o n o f p E T 30a -C P 204L 图2 重组p 30蛋白的S D S -P A G E 检测F i g
.2 S D S -P A G E d e t e c t i o n o f r e c o m b i n a n t p 30p r o t e i n 表明获得的2株A S F V p 30蛋白的单抗与真核表达
p
30蛋白均具有良好的特异性㊂2.5 单克隆抗体抗原表位鉴定
A S F V p 30蛋白二级结构由无规卷曲㊁α螺旋㊁β
9
143
畜 牧 兽 医 学 报54卷
A.重组蛋白纯化结果;B .W e s t e r n b l o t 鉴定纯化的蛋白
A.P u r i f i c a t i o n r e s u l t s o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n s ;B .W e s t e r n b l o t i d e n t i f i c a t i o n o f p u r i f i e d p r o t e i n s
图3 重组p 30蛋白的纯化及鉴定F i g
.3 P u r i f i c a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f r e c o m b i n a n t p 30p r o t e i
n A.W e s t e r n b l o t 鉴定p 30单克隆抗体的特异性;B .I F A 鉴定p 30单克隆抗体的特异性
A.W e s t e r n b l o t i d e n t i f i c a t i o n o f t h e s p e c i f i c i t y o f p 30m o n o c l o n a l a n t i b o d y ;B .T h e s p e c i f i c i t y o
f I F A i d e n t i f i c a t i o n o f p 30m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s 图4 抗p 30蛋白单克隆抗体与p 30蛋白反应特性鉴定F i
g .4 A n a l y s i s o f t
h e r e a c t
i v i t y o f a n t i -p 30m o n o c l o n a l a n t i b o d y w
i t h p 30p r o t e i n 折叠构成(图5A ),对p 30肽段进行截短,
保证每段α螺旋㊁β折叠的完整,进一步W e s t e r n b l o t 分析,结果表明A S F V -P 30识别的氨基酸序列范围是C 端
170~194a a 共25个氨基酸,氨基酸序列为:I Y G T -P L K E E E K E V V R L MV I K L L K K K (图5B )㊂在p 30
蛋白三级结构可视化的基础上,标注出p 30单克隆抗体识别抗原表位区域170~194a a (图5C ,
以红色区域表示)
㊂3 讨 论
非洲猪瘟病毒作为非洲猪瘟病毒科唯一成员,
碱基数多达17万~19万个,基因组庞大,能够编码多种蛋白质,包括结构蛋白和免疫调节蛋白,其结构和免疫逃逸机制复杂,能够逃避宿主免疫细胞的清
除,但其与宿主细胞的互作机制尚不清晰㊂针对非洲猪瘟的各种疫苗策略已经进行了研究,早期侧重于以抗原为基础的方法,旨在诱导中和血清学反应,以C D 2v 为抗原不能引起机体足够的免疫保护,此后,许多亚单位疫苗的方法都集中在p 54和p 30,数据结果显示p 54和p 30同时免疫机体可延缓A S F V 临床症状,因此深入对A S F V 蛋白质组和单个蛋白质功能的研究,对合理设计靶向疫苗方法具有重要
意义[
17-19]
㊂现阶段对非洲猪瘟的控制主要依靠传统的措
施:动物一旦确诊感染,立刻采取全扑杀以防范A S -
F V 的进一步扩散和蔓延㊂因此,
快速准确的诊断识别A S F 是该病流行病学管理的关键㊂目前主要将p 72㊁p 54㊁p
30蛋白作为诊断抗原用于A S F V 感0
243
8期
刘桃雪等:非洲猪瘟病毒p 30蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定
A.A S F V p 30蛋白二级结构预测结果;B .A S F V p 30蛋白截短示意图及抗原表位鉴定(M.蛋白分子量M a r k e r ;1.
p G E X 4T -p 30;2.p G E X 4T -p 30-Δ1;3.p G E X 4T -p 30-Δ2;4.p G E X 4T -p 30-Δ3;5.p G E X 4T -p 30-Δ4;6.p G E X 4T -p
30-Δ5;7.p G E X 4T -p
30-Δ6);C .A S F V p 30蛋白的三级结构A P r e d i c t i o n r e s u l t s o f t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f A S F V p 30p r o t e i n ;B .A S F V p 30p r o t e i n t r u n c a t i o n s c h e m a t i c a n d a n t i g
e n e p i t o p e i d e n t i
f i c a t i o n (M.P r o t e i n m a r k e r ;1.p G E X 4T -p 30;2.p G E X 4T -p 30-Δ1;3.p G E X 4T -p 30-Δ2;4.p G E X 4T -p
30-Δ3;5.p G E X 4T -p 30-Δ4;6.p G E X 4T -p 30-Δ5;7.p G E X 4T -p 30-Δ6);C .T h e t e r t i a r y s
t r u c t u r e o f A S F V p 30p r o t e i n 图5 单克隆抗体2G 10-2和6D 2-1抗原表位鉴定F i g .5 E p i t o p
e s i d e n t i
f i c a t i o n o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s 2G 10-2a n d 6D 2-1染时的血清学诊断㊂有研究表明,与p 54蛋白相比,可能由于p 30拥有构象表位,在E L I S A 上的灵敏度
更高[20]
㊂且p 30蛋白在A S F V 感染后2~4h 即可
表达,能诱导中和抗体的产生,在整个感染期都能检测到,更适用于早期诊断㊂因此本研究通过原核表达系统,获得了纯度较高的可溶性p 30蛋白,建立了获得可溶性p 30蛋白的体系,且蛋白纯度高,经鉴定具有良好的反应原性,可用于间接E L I S A 来检测
A S F V 的感染㊂进一步利用p 30蛋白免疫小鼠,
制备了高特异性的p 30单克隆抗体,可应用于阻断E L I S A 方法的建立,
这为血清学检测方法的进一步发展提供了材料㊂
研究病毒蛋白的特性及评估p 30蛋白的抗原表
位特征,尤其是保守表位特征,有助于研究人员更好理解病毒的生物特性和宿主的免疫反应机制,还能为发展和改进A S F 诊断和监测的血清学检测方法以及疫苗的研发提供重要信息[21-22]
㊂P e t r o v a n
等
[23]
的研究初步鉴定了p 30的61~93位氨基酸之
间的表位,该区域也被A S F V 感染猪的血清识别,提示该区域是具有重要免疫功能的表位[
24]
㊂同时1
243
畜牧兽医学报54卷
也鉴定了p30蛋白C端部分中的一个大多肽片段(120~204a a)与高度柔性和潜在无序倾向区域(91~143a a)部分重叠可能是p30蛋白的抗原表位区域,该结果与本研究的试验结果相似㊂本研究进一步缩小了p30蛋白的抗原表位分布范围㊂目前已有研究报道A S F V病毒颗粒[25]㊁p54蛋白[26]和p72[8]蛋白的结构解析,但是没有关于p30蛋白结构解析的报道,故本研究通过I-T A S S E R软件在线预测A S F V p30蛋白三级结构,并标注出p30单克隆抗体识别的抗原表位区域,为A S F V p30蛋白结构的研究奠定了基础㊂
4结论
本研究制备了2株非洲猪瘟病毒C h i n a/2018/ A n h u i X C G Q-A S F V毒株p30蛋白的单克隆抗体,同时利用蛋白截短表达的方式鉴定了170I~K194是其识别的抗原表位区域,进一步通过I-T A S S E R软件在线预测A S F V p30蛋白三级结构,并标注出p30单克隆抗体识别的抗原表位区域,丰富了p30蛋白的抗原表位信息,为A S F V p30蛋白结构的研究及血清学检测方法的进一步发展奠定了基础㊂参考文献(R e f e r e n c e s):
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