植物芪类次生代谢物的功能、合成调控及基因工程研究进展

芪类是一类次生代谢物，
是在葡萄、花生和松树等多个科的植物中分离鉴定得出。

它们多在各种诱发因子或植物病原菌的侵染作用下诱导合成，具有抗病及对人体健康的保健作用等多种生物活性。

随着分子生物学研究的深入及其相关研究手段向植物次生代谢研究的渗透和应用，近一、二十年来，芪类次生代谢物的生物学功能、代谢调控及基因工程等研究领域均取得了重要的进展，芪类次生代谢基因
工程已成为植物次生代谢途径基因工程（engineer-ing of secondary metabolism ）成功的典范。

本文对上述方面进行综述，为进一步开展白藜芦醇等芪类次生代谢物在作物品质改良中应用的研究奠定基础。

1植物芪类次生代谢物合成及其功能
1.1芪类次生代谢物的基本结构
芪属于多酚类次生代谢物，其基本结构由2C
桥连接的两个芳香环（C6C2C6）构成，其中两个C
桥之间含有烯键。

已在豆科、葡萄科、松科和禾本科、买麻藤科、禾本科、蓼科、青梅属等不同的植物中分离、鉴定出多种芪类次生代谢物。

Langcake 和Pryce [1]
首先在真菌（）侵染的葡萄中发现
白藜芦醇，在葡萄中发现的多种芪类次生物中，白藜芦醇含量占绝大部分，α-viniferin 和ε-viniferin 是由白藜芦醇进一步聚合反应而合成。

在山葡萄中也分离鉴定出(+)-hopeaphenol,isohopeaphenol,vitisin A,(+)-vitisifuran A,和heyneanol A 等多种白藜芦醇四聚体芪类次生代谢物[2]。

在葡萄中虽也鉴定出了
*基金项目：福建省自然科学基金重大项目（No.2002F009）。

何水林：男，1965年生，博士，教授。

E-mail:<hsl324@>.收稿日期:2002-07-30接受日期:2003-05-16
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(1):102~108
·综述·
植物芪类次生代谢物的功能、合成调控及基因工程研究进展*
何水林1**
郑金贵2林
明2王燕华2
（1.福建农林大学作物学院;2.福建农林大学生物中心，福州350002）
摘要：芪类(stilbenes)是松树、葡萄和花生等植物中发现的具有抗病及保健等多种功能的次生代谢物。

芪合酶是芪类次生代谢物合成途径的关键酶。

植物大多数芪类次生代谢物都具有诱导合成的特性，
它们的诱导合成是芪合酶基因在各种诱发因子作用下被诱导转录和翻译的结果。

利用已克隆的芪合酶基因，可在转基因植物中引入芪类合成支路以合成芪类次生产物，从而达到改变转基因植物抗性及保健品质的目的。

关键词：芪类次生代谢物;代谢调控;基因工程
Advances of Biological Function,Regulatory Mechanism of Biosynthesis and
Genetic Engineering of Stilbenes
HE Shui-Lin 1ZHENG Jin-Gui 2LIN Ming 2WANG Yan-Hua 2
(1.Biotechnology center,College of Crop Science,Fujian Agriculture and Forestry University ；2.Biotechnololgy center.Fujan Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China )Stilbenes,which are derived from the phenylphnenoid pathway,have been detected in
et al.Stilbenes are phytoalexins in plants and many studies have also shown that this kind of secondary
metabolites have many health benefits.Stilbene synthase (STS)is the key enzyme in the biosynthetic pathway of stilbenes ,and the gene transcription and translation is inducible by pathogens or by various elicitors.With STS gene available,the biosynthesis pathway could be introduced into transgenic plants to synthesize stilbenes in order to improve the disease resistance and health caring quality of
crops.
stilbenes;regulation of biosysthesis;genetic engineering
第1期何水林等：植物芪类次生代谢物的功能、合成调控及基因工程研究进展
紫檀芪，但其含量非常低[3]。

在花生中分离鉴定的芪类次生代谢物有白藜芦醇[4，5]、ArachidinⅠ、ArachidinⅡ、ArachidinⅢ和ArachidinⅣ[6]。

从松树中分离鉴定的芪类次生代谢物有pinosylvin及其衍生物；在禾本科植物甘蔗中发现piceatannol。

在锦鸡儿（）植物中发现了pallidol,kobophenol A, miyabenol C和α-viniferin等寡聚白藜芦醇芪类次生代谢物[7]。

在垂子买麻藤中已分离出白藜芦醇、isorhapontigenin、shegansu B和β-daucosterol等芪类次生代谢物[8]。

此外，还在
中鉴定出了5-methoxy-(E)-resveratrol3-O-rutinoside 等芪类糖苷[9]。

1.2芪类次生代谢物的生物活性
现已发现，芪类次生代谢物具有抗病、抗氧化、抗肿瘤、抗炎症、抗雌激素及抗血小板凝固等多种生物活性，在植物防御反应及人类健康保健等多个领域均具有重要的应用开发潜力。

1.2.1抗菌迄今已发现的不同芪类次生代谢物均具有不同程度的杀真菌活性。

例如，从红兰门醇衍生而来的各种芪类次生代谢物对
和
的半致死浓度50（半致死浓度）介于10到50μg/m之间。

相对而言，真菌孢子的萌发比菌丝的生长对芪类次生代谢物更为敏感。

白藜芦醇对
菌丝生长的50为50μg/mL[4]，对葡萄病原菌和孢子萌发的50在71~200μg/mL之间。

不同的研究发现ε-viniferin对各种真菌的50在19~200μg/mL之间[1]。

Arachidin I-IV等花生芪类次生代谢物对
spp.和
的50在3.6~6.3μg/mL之间，真菌孢子萌发也较真菌菌丝的生长对花生芪类次生代谢物更为敏感[11]。

此外，最近还发现在食品中含有的白藜芦醇对人体皮肤表皮真菌和细菌性病原菌均具有拮抗作用，在171~342μg/mL剂量的白藜芦醇下，
,
等细菌的生长均受到抑制；
和
等真菌性病原菌在25~50μg/mL剂量的白藜芦醇作用下生长受到显著的抑制[11]，表明白藜芦醇等芪类次生代谢物在人的皮肤病治疗上也具有开发应用潜力。

1.2.2抗氧化白藜芦醇对预防心脏病有效，据报道，摄入高脂肪的法国人心脏病发生率很低与法国人喝的葡萄酒中富含的白藜芦醇有关，每升葡萄酒中白藜芦醇含量高达1.5~3.0mg。

白藜芦醇预防心脏病等心血管疾病的效果与其抗氧化作用有关，白藜芦醇可影响人体的脂肪的代谢，可阻止人体细胞低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）的过氧化作用，从而减少氧化LDL对人体细胞的毒性，并保护细胞避免膜脂过氧化。

由于白藜芦醇的高亲水性和亲脂性，其抗氧化作用比其它抗氧化剂都要强。

白藜芦醇的寡聚体α-viniferin、ε-viniferin等也具有不同程度的抗氧化作用,ε-viniferin在DMSO/O2-的极性系统((50)=0.14mmol/L)中表现出最大抗氧化活性,而4,4'-dihydroxystilbene则在O/W/LOO系统中表现出最大抗氧化活性(使β-胡萝卜素的漂白率被抑制82%)[12]。

veraphenol, resveratrol,piceid,isorhapontin,和mulberroside E等在植物细胞外均可抑制黄嘌呤氧化酶(XO,EC 1.2.3.2.)活性，黄嘌呤氧化酶活性被抑制的程度与上述芪类次生代谢物的浓度高度相关[13]。

白藜芦醇的抗氧化作用与其对癌症发生、发展的抑制作用及对人类心血管疾病的治疗作用有密切的关系[8]。

1.2.3克制肿瘤发生及癌变白藜芦醇还对肿瘤、癌细胞和白血病均具有克制作用，例如，在2.5~10 mg/kg的剂量范围内，白藜芦醇可使小白鼠的肿瘤体积减小42%,重量降低44%，使肿瘤向肺部的移减慢56%[14]。

白藜芦醇可在癌症的发生、发展和加重等各个阶段发生作用。

对于癌症的发生阶段，用白藜芦醇处理可充当抗氧化剂作用，减少自由基的产生并充当抗原；对于发展阶段的癌症，白藜芦醇通过抑制环氧化酶（cyclooxygenase-1，COX-1)，阻止COX-1催化茉莉酸转化为引发炎症的物质；在癌症加重阶段，白藜芦醇可诱导人体早优粒细胞和白血病细胞发生变异，抑制核糖核酸还原酶，使增殖细胞中DNA的合成受阻从而逆转癌细胞的发育进程，但却对人体的造血细胞杀伤力很小。

白藜芦醇的保健功能与其对人体免疫系统的影响有关，在20~50 mmol/L的浓度下，白藜芦醇对促分裂原/抗原诱导的人体脾淋巴增生具有显著的抑制作用，对细胞分裂素的合成也具有不可逆转的抑制作用。

白藜芦醇对淋巴增生及细胞分裂素合成的抑制作用与其抑制转录因子NF-kappaB的激活及对肿瘤细胞中细胞分裂增生的S期向G2期演进的抑制作用有关[15]。

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农业生物技术学报2004年
白藜芦醇也可导致肿瘤细胞、脊髓白血病细胞和原淋巴白血病细胞程序性死亡[16,17]。

白藜芦醇的抗肿瘤或癌症的作用与其抑制细胞中NO的产生、抑制脂多糖对核因子kappa B的诱导、抑制核因子抑制子kappa B alpha的磷酸化、及对细胞有丝分裂过程中信号传导过程的影响等均有一定关系[8]。

1.3芪类次生代谢物生物活性的分子结构基础及其作用机制
芪类次生代谢物杀菌活性与其分子结构电子共轭系统及由此而形成的电荷转移复合体（charge tranfer complexes,CTCs）有关[18,19]。

一般多酚类植保素至少具有一个苯酚基团，在其分子内可形成电子共轭系统，其中交替分布的单双键的电子可以移动，造成分子内电子流（图1）。

芪、羟基-芪、反-香豆酸等就具有这样的共轭系统。

共轭系统导致了CTCs的形成，CTCs有利于芪与蛋白质结合并产生亲和力（affinity），特别是蛋白质中的芳香族氨基酸与电子受体结合成CTCs的能力更强。

芪可充当电子传递的解耦联剂，与细胞酶蛋白作用形成多酚-蛋白质复合体[18]，使质体上电子传递和光合磷酸化解耦联[19]。

羟基-芪上的电子共轭系统也可导致CTCs，它的生物活性依赖于σ值（σ表示基团吸收或提供电子的能力），当取代基砸吸收电子的能力增强时，加速共轭系统内电子的流动，提高芪分子的极性。

例如，取代基R为甲氧基时（即紫檀芪），它比CH3、Cl、OH等其它取代基更能扰乱分子间键，甲氧基的存在可能导致氢键的形成，CTCs和氢键使紫檀芪更容易与细胞膜蛋白结合[20]。

芪类植保素通过与细胞色素氧化酶等膜蛋白结合，使电子从黄素向底物的传递受阻，产生自由基，导致细胞膜的膜脂过氧化。

膜蛋白中的酪氨酸等芳香族氨基酸特别有利于与具有电子共轭系统的植保素形成CTCs，从而促进芪类次生代谢物与膜蛋白的结合，增强植保素的抗病活性[20]。

但是，现在还不清楚芪类植保素的抗病机制与白藜芦醇的抗氧化作用之间的关系，最近有研究表明白藜芦醇的抗氧化活性与其中的自由羟基有关[13]。

2芪类次生代谢物合成调控机制
2.1芪类次生代谢物的生物合成途径及其调控
芪类次生代谢物是植物通过苯丙氨酸代谢途径合成的。

在苯丙氨酸代谢途径中，苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶（PAL）催化作用下可裂解成反-肉桂酸,随后肉桂酸的芳香环经多次羟基化作用（hydroxylations）和依次甲基化作用（methyla-tion），合成4种替代肉桂酸即香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸等。

其中由肉桂酸合成反-香豆酸的反应是在肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）的催化作用下进行的。

香豆酸-CoA和两个丙二酰-CoA可在芪合酶催化作用下合成芪类次生代谢物，香豆素-CoA等也可在查尔酮合成酶（CHS）的催化作用下进入黄酮类和异黄酮类合成支路(图1)。

芪类次生代谢物的合成受到PAL、4CL（香豆酰-CoA连接酶）、C4H、STS、PMT(赤松素-甲氧基转移酶)甚至CHS等多个酶促反应的调节控制。

其中最关键的调节酶是STS[21]。

STS的底物专一性不高，而且通过改变芪合酶的催化底物,可一定程度地改变其合成的产物[22]。

芪类次生代谢途径中有关酶如PAL和STS在诱发因子作用下具有协同表达[23]。

而且在植物基因组中存在这些酶编码基因的多基因家族，因此，芪类次生代谢物的诱导合成可能涉及到复杂的代谢频道（metabolic channel）调节机制。

在已发现的芪类次生代谢物中，大多数具有病原菌侵染或诱发因子（包括UV、O3等）诱导合成的特点，在植物中可充当植保素[21]，即在一般条件下其合成途径被关闭，病原菌或各种诱发因子诱导的激活可启动其合成途径。

芪类植保素的诱导合成与其生物合成途径中各个酶诱导表达有关，而酶活性的诱导表达又与相应的基因的诱导转录有关。

例如，在O3的诱导作用下的欧洲赤松的松针中及在真菌诱发因子作用下的欧洲赤松悬浮细胞中，STS和PMT 等基因被诱导转录并表达出酶活性[24]。

花生培养细胞和植株中在生物或非生物诱发因子作用下，STS 基因mRNA的积累量增加[25]。

生物合成途径中调节酶受逆境及诱发因子诱导而表达，白藜芦醇受诱导而增加合成的特性可应用于作物保健品质提高的工程措施中，例如Cantos等[26]利用紫外线照射提高葡萄中白藜芦醇含量以获得具有较高保健价值的“功能水果葡萄”，他们研究发现在“拿破仑食用”葡萄在辐射能量为510W，辐射时间为30s,辐射距离为40cm，辐射后放置时间为3d的处理下可获得最高的白藜芦醇含量（白藜芦醇含量为对照的11倍），而颜色、重量、硬度、香气、大小、成熟指数和维生素C含量等各项指标在贮藏1周后较对照没有明显的差异。

经UV照射后每200g葡萄中含有相当于三杯葡萄酒中的白藜芦醇（3mg）。

在UV-C的照射下，葡萄浆果中可合成白藜芦醇,piceid,ε-viniferin 和紫檀芪等芪类次生代谢物[27]，从而提高了葡萄浆果的营养保健品质。

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第1期何水林等：植物芪类次生代谢物的功能、
合成调控及基因工程研究进展图1.植物芪类次生代谢物生物合成途
Fig .1.The metabolic pathway of stilbenoids and flavonoids in plants
2.2植物芪合酶基因的结构和功能STS 基因在植物中多以基因家族存在，基因家族成员的多样性来源于基因的复制及在此基础上的插入/缺失突变。

这种基因多样性可能是生态环境作用的最终结果。

已从松树[28,29]、花生[30]、葡萄[31~33]，等植物中分离了芪合酶基因。

这些基因的分离为芪类次生代谢物生物合成调控机制的研究奠定了重要基础。

所分离的STS 的cDNA 具有390个左右氨基酸的开放读码框（ORF ），同一种植物STS 家族不同成员之间及同一科植物不同品种基因的编码序列之间具有高度的同源性，但其基因的5'调控序列之间具有较大的差异，与不同等位基因的组织、器官特异性表达及对诱发因子的特异性响应有关。

例如，欧洲赤松基因组中具有多个PTS （赤松素合成酶）等位基因，按内含子的大小，可将从赤松基因组中分离的10个等位基因分为5类，其中,,和的cDNA 之间的同源性高达95%以上。

不同种植物的STS 编码序列之间也有一定的同源序列。

目前已克隆的STS 基因可分为两种类型，一种是反香豆酰-CoA 底物特异性类型即白藜芦醇合成酶(EC 2.
3.1.95)，另一种是肉桂酰-CoA 底物特
异性类型即赤松素合成酶（EC 2.3.1.146）。

葡萄、
花生等植物中STS 属于前一种类型，而存在于苏格兰赤松（）和东方白松（）等属于后一种类型。

CHS 和STS 均属于聚酮合成酶（polyketide synthase ，PKS ），均催化可
催化反-香豆酰-CoA 和丙二酰-CoA 的3个C2单位缩合反应，但合成的反应产物前者是naringenin 查尔酮，而后者是白藜芦醇等芪类次生代谢物。

现有一般认为，STS 是植物在进化过程
中从
基因进化而来的，彼此之间有65%以上的氨
基酸同源序列。

不仅如此，
CHS 和STS 之间在催化位点功能上仍具有一定的可变性。

例如，将花生的STS 和野葛CHS cDNA 分别在
大肠杆菌中表达，
它们的表达产物存在着部分重叠，即
在CHS 催化产物中有白藜
芦醇（约为naringenin 量的2.7%~4.2%），而在STS
的催化产物中含有有naringenin （约为白藜芦醇量
的1.4%~2.3%）[34]。

迄今已发现的大多数STS 基因均具有诱导表达的特性，可作为植物逆境胁迫十分灵敏的检测工具[35]。

STS 基因的诱导表达与其调控序列中不同部位的G 、H 、GC 和W 盒等顺式元件及其与Myb 等转录因子作用有关。

不同诱发因子对STS 基因诱导的分子机制有所差异。

例如，STS 基因调控序列中W 盒与基因对病原菌侵染的响应有关，而G 、H 和GC 等盒则与基因对其它非生物逆境胁迫的响应有
关[36]。

葡萄白藜芦醇合成酶基因Vst1启动子中响应
O3的顺式作用元件位于-430~-280bp 之间，而响
应病原菌侵染的顺式作用元件位于-280~-140bp
之间[30]。

在松树中发现PST 各等位基因的启动子中TATAA 盒附近的区域几乎相同，但更上游的区域
彼此间有很大的差异[37]。

STS 基因在被诱导表达过程中与PAL 等苯丙氨酸途径中上游有关酶的基因家族中的某些成员具有协同表达现象[23,24]。

3植物芪类次生代谢物生物合成途径的基因工程由于芪合酶在白藜芦醇等芪类次生代谢物生物
合成途径中的重要调节作用，芪合酶的基因工程应用研究受到了人们的高度重视，并取得了重要的进
展。

105
农业生物技术学报2004年
在葡萄、花生、松树等植物中具有诱导型芪合酶基因的表达机制，但大多数植物细胞中虽然有STS 酶的底物，但缺少STS基因，从而缺乏在诱发因子作用下合成该类植保素的能力。

通过基因添加技术将芪合酶基因导入到目标植物基因组中，可望使转基因植物表达芪合酶活性，启动芪类次生代谢合成途径，从而可改变植物性状。

Hain等[39]构建了花生STS基因与卡那霉素抗性基因的嵌合基因，并将该嵌合基因转入到烟草原生质体的基因组中，转化烟草悬浮细胞培养物在真菌细胞壁诱发因子或紫外线诱导作用下表达STS酶活性。

在紫外线和真菌细胞壁诱发因子处理后10和30min的烟草转化愈伤组织检测出STS的mRNA。

尽管诱导表达的STS酶活性只有花生悬浮细胞中的十分之一，但这两个系统中STS酶活性表达的动态特征一致。

为了进一步获得具有杀菌能力的植保素含量水平转基因烟草，Hain等[39]及其同事又从葡萄中分离出STS基因和，将、基因与植物选择基因和报道基因连接，一道转入烟草原生质体基因组，检测再生愈伤组织和再生植株中STS基因转录、酶活性表达和白藜芦醇植保素表达情况，表明转化植物在诱发因子作用下外源基因发生了转录，并表达出STS酶活性。

为了检测该策略对于植物抗病的效果，该研究小组用烟草病原菌(灰霉)侵染烟草，结果表明野生型和不表达STS 酶活性的对照烟草组合中，烟草不表现抗性，而23D17的转化烟草表现出持续抗性，而24D1的转化烟草表现出非持续抗性。

分析mRNA的积累水平，结果表明23D17的最大mRNA表达时间比24D1快几个小时，这种表达时间上的差异可能是两株转基因植株在抗性上差异的主要原因。

两株转基因植物的最大mRNA积累时间与最高浓度白藜芦醇的出现时间基本一致。

该结果说明，通过基因的添加，使植物合成外源植保素，从而提高植物的抗病作用从技术上来说是可行的。

此外，许多研究者们还将STS基因分别转入油菜、水稻、大麦、小麦等作物中，均获得了抗病性有所增强的转基因植株。

例如，转STS基因水稻抗白叶枯病和稻瘟病水平均有所增强[40，41]将葡萄的STS基因转入小麦中，获得5个转化植株，其中2株的T3代植株中鉴定出1个对白粉病免疫植株和3个对白粉病中抗的植株。

结构基因的基因工程中，启动子是影响基因表达时间、部位、效率、及对不同诱发因子响应，从而影响转基因植物应用价值的一个重要因素。

在芪合酶基因工程中，最近有人应用高效诱导型启动子，取得了良好的效果。

在葡萄中白藜芦醇虽是一种主要植保素,但随着葡萄的成熟,即使在病原菌的侵染作用下,其合成白藜芦醇的能力下降,白藜芦醇在葡萄成熟后期抗病作用因此而下降。

将苜蓿PR10诱导型启动子与葡萄芪合酶1(Vst1)构建嵌合基因,导入到葡萄中,分析所获得的50个转基因植株,发现其中其中一部分白藜芦醇含量较对照低,另一部分转基因植株白藜芦醇含量是对照的5~100倍,这部分植株在病原菌侵染作用下的病害症状也大大降低。

表明病原菌诱导型启动子与防御基因的结合应用是作物抗病基因工程的有效途径[42]。

迄今有关芪合酶基因工程研究的目标主要是植物抗病的遗传改良，而有关芪合酶基因工程在植物营养、保健品质遗传改良上应用方面还未见到报道。

4结语
植物次生代谢途径基因工程研究是当今植物生物工程研究的一个热点，然而，由于植物次生代谢物合成途径涉及多个反应步骤，其调控机制十分复杂。

相对于黄酮类和异黄酮类次生代谢物生物合成而言，芪类次生代谢物的合成途径相对较短，其调节机制相对简单。

通过芪合酶的基因工程，可望在目标植物中引入白藜芦醇等芪类次生代谢物的合成支路。

白藜芦醇等芪类次生代谢物不仅具有抗病作用，还具有抗氧化、抗肿瘤等多种保健功能，在人类身体的健康保健中有重要的应用前景。

强化白藜芦醇等诱导型次生代谢物抗病、保健功能有以下两条途径，一是通过开发高效、安全、廉价和便利的诱发因子诱导方法来提高植物材料中的有用芪类次生代谢物的合成、积累量；二是通过基因工程，可提高转基因植物合成外源芪类次生代谢物的含量，特别是利用本身保健功能比较强的作物，作为生物反应器来合成外源白藜芦醇等芪类次生代谢物，将不仅有利于提高转基因植物抗病水平，减少其大田生产过程中的农药施用量，从而提高其卫生品质；而且还可望提高其保健品质，以满足人类对保健性食品日益提高的需要。

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