HPLC仪器图

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梯度洗脱（gradient)
梯度洗脱（溶剂程序）：在同一个分析周期内按 一定的程序改变流动相的组成,从而改变流动相 极性、离子强度、pH，来调整组分的k值，改变 分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离 的目的。 ●梯度洗脱的特点 ●梯度洗脱的主要条件 ●梯度洗脱的基本原理
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3．操作条件差别 GC： 加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 3/8/2019
第三节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪的结构示意图：一般可分为五个主要 部分：高压输液系统，进样系统，分离系统, 检测系统和数据处理及控制系统。此外还配有 辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。
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I kmb lg I b lg m lg k
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五
•五.数据记录系统和控制系统
色谱工作站 计算机：控制显示
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色谱工作站（计算机 ）：控制显示
流动相 供给和 输送
进样
分离
检测
记录、 数据处 理
温度控 制
收集
◆
流路系统（分析单元）：高、低压流路
◆ 3/8/2019 电路系统（控制单元）：信号传输与处理
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工作原理
当复合光透过流通池后,被组分吸收,其透过光具有 了组分的光谱吸收特征.此透过光被光栅分光后,形 成组分的吸收光谱,照到光电二极管阵列装置上,使 每个纳米光波的光强转化为相应的电信号,给出组分 的吸收光谱. 本检测器可以同时获得样品的色谱图(C-t)及每个色 谱峰的吸收光谱(A-入),得到三维光谱-色谱图,可以 同时得到定性和定量及色谱峰是否单一组分的信息 .
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b. 光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器： 1024 个二极管阵列，各检 测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如 图所示。
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光电二极管阵列检测器构造
• 光电转换元件是:光电二极管,即晶体硅(体积 仅50ul),如Agilent 1100型光电二极管阵列检 测器,波长范围为190-950nm对应1024个光电二 极管,平均0.74nm谱带区间,由一个光电二极管 接收.
构造 构造
I km
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b
lg I b lg m lg k
检测机理 工作原理
• 1.雾化过程:形成细小均 匀的雾状液滴 • 2.流动相蒸发过程:流动 相蒸发,样品分子形成雾 状颗粒. • 3.检测过程:670nm激光 束的照射,产生散射光, 其被硅晶体光电二极管 产生电信号
3/8/2019 据采集和控制系统
(二).主要部件
1.高压输液系统 高压输液泵:主要部件之一，压力：15～35 MPa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
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发展：
1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的 局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大 分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经 典液相色谱。1960年代末科克兰（Kirkland）、 哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等 人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了 高效液相色谱的时代。
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c. 示差折光检测器
（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。 差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质 具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感 、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型 三种；
柱内径1-3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
2．HPLC：分离和分析
柱内径2-6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测 3/8/2019
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高效液相色谱法(HPLC)
high performance liquid chromatograph
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概述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代 初发展起来的一种新型分离分析技术，它是在经典液 相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采 用了高压驱动流动相 、高效固定相和高灵敏度检测 器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动 化的特点。
手动进样器、六通阀、定量环
Load
Inject
六通阀定量环 通废液口
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定量环
进柱
仪器：自 动进样器 自动进样器
样品盘
机械手
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自动进样100样品盘、机器手、自动洗针
分离系统
高效分离柱:柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长
5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
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第三节
高效液相色谱仪
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• Agilent 1200液相色谱系统
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液相色谱仪（4）
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高效液相色谱仪的仪器流程
(process and main assembly of HPLC)
高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数
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2．梯度洗脱的主要条件
① A 流动相/弱溶剂组成； ② B 流动相/强溶剂组成； ③ 梯度时间；
强溶剂 A%
④ 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。
time
5
2
1
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2.进样系统
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通 阀进样装置，其结构如图所示：
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色谱柱、柱温箱、色谱柱外挂架
柱温箱
外挂架
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4. 检测系统
a. 紫外检测器
应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
梯度洗脱的作用 1．梯度洗脱的特点
（1）提高分离度，加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, （3）提高检测的灵敏度， 有利于痕 量组分的检测； （4）增加峰容量； （5）强烈滞留的组分不容易残留在柱
上, 保持柱性能长期良好；
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(2)梯度淋洗装置
外梯度: 利用两台高压 输液泵，将两种不同极 性的溶剂按一定的比例 送入梯度混合室，混合 后进入色谱柱。 内梯度:一台高压泵, 通 过比例调节阀,将两种或 多种不同极性的溶剂按 一定的比例抽入高压泵 中混合。
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•高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提 高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液 相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个 小时甚至几十分钟内完成。
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法 (HPLC)正式建立。
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示差折光检测器3/8/209荧光检测器（fluorescence detector）
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素 B、黄曲 霉素、卟啉类化合物、农药 、药物、氨基酸、甾类化合 物等有响应；
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蒸发光散射检测器（ELSD）
evaporative light scattering detector
仪器：化学工作站
进样器 高压泵 流动相 色谱柱 检测器
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数据处理
高效液相色谱的工作流程
首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送
入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分 离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同 时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测 器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得 到液相色谱图。
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相同：兼具分离和分析功能，均可以在 线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的 差别
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2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
二、HPLC与GC差别
1．分析对象 GC： 能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC： 溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热 稳定性的限制 , 分子量大、难气化、热稳定性差 及高分子和离子型样品均可检测 ,用途广泛，占有 机物的80%
• 1970年后，适合分离生物大分子的填料 又成为研究的热点。1980年后，改善分 离的选择性成为色谱工作者的主要问题， 人们越来越认识到改变流动相的组成事 提高选择性的关键。
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一、HPLC与经典LC区别
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 1．经典LC：仅做为一种分离手段
（动画）
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• 流动相的预处理：
• 在使用前必须进行脱气处理，以防止在洗脱过程 中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低 而产生气泡
• • • • 抽真空脱气 吹氦脱气 加热回流脱气 超声波脱气
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流动相的洗脱方式
• 等强度洗脱（isocratic):样品的组成较简单， 各组分的分配系数值相差不大。在同一分析周 期内流动相的组成保持恒定。 • 梯度洗脱（gradient)：样品的组成较复杂，各 组分的分配系数值相差大，即宽分配比的组分
• 此类检测器是上世纪90年代出现的最新型的泛 用检测器.可用于挥发性低于流动相的任何样 品组分的检测.但灵敏度低于紫外光度型.因而 主要用于糖类,高分子化合物,高级脂肪酸及甾 体类等几十类化合物. • 构造 • 检测机理
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步骤一 ：雾化 柱洗脱液进入雾化器针管，在针的末端，洗脱液和氮气混合形成均匀 的微小雾状液滴 步骤二：流动相的蒸发 液滴流经加热的漂移管时，流动相蒸发，样品在溶剂蒸气中 形成雾状微小颗粒，悬浮在溶剂蒸气中 步骤三：检测 样品小颗粒进入流动池时，经过一束激光 ,颗粒散射激光,经硅晶体光电 二极管检测散射光，并产生电信号 。 3/8/2019
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