甘蔗MYB2转录因子的电子克隆和生物信息学分析_李国印
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核酸及氨基酸序列组成分析、理化性质分析、开 放阅读框（ open reading frame，ORF） 的查找和翻译， 利 用 DNAstar 软 件 及 Prot － Param、pI / Mw、ORF Finder 等在线工具进行； 核酸和氨基酸序列的同源 性比对及多序列比对利用 Blast 和 Clustal W 在线工 具 完 成； 亲 水 性 /疏 水 性 的 分 析 利 用 在 线 工 具 ProtScale 完成； 蛋白质二级及三级结构的预测利用 SOPMA 和 ESyPred3D 等在线工具完成［5，6］。
图 3 显示，多肽链的第 181 号的亮氨酸基（ Leu） 具有最高的分值 2． 256，疏水性最强； 第 16 号的甘氨 酸（ Gly） 具有最低的分值 － 2． 45，其次是第 103 号的 酪氨酸（ Tyr） ，为 － 2． 18，均属于亲水性氨基酸。进 一步 比 较 玉 米 （ Gene Id： 732760 ） 、小 麦 （ GeneID： 543160） 和拟南芥（ GeneID： 819332） 中的 MYB2 多肽 链的亲水性和疏水性，其结果均显示亲水特性。由此 预测甘蔗 MYB2 蛋白属于亲水性蛋白。 2． 5 甘蔗 MYB2 蛋白的亚细胞定位
植物 MYB2 转录因子是 MYB 大家族中一个小 的亚族，虽然不同植物的 MYB2 基因具有不同的生 物 学 功 能［2，3］，但 它 们 都 是 在 转 录 水 平 上 调 控 植 物
各个阶段的生长发育。通过突变体及基因敲除技 术，已克隆了很多植物 MYB 类基因，但在甘蔗 MYB 方面研究甚少。
李国印，阙友雄，许莉萍* ，郭晋隆，闫学兵，陈如凯
（ 福建农林大学 农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室，福建 福州 350002）
摘 要： 用电子克隆方法获得甘蔗 MYB2 基因，采用生物信息学方法，对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构 域、疏水性 / 亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明： 甘蔗 MYB2 基因全长 991 bp，包含 570 bp 的 ORF，编码 189 个氨基酸。甘蔗 MYB2 基因包含有 MYB 功能域，在序列组成、高级结构及活性位点等方面，与玉米等 其它植物的 MYB2 基因具有高度的相似性。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。 关键词： 甘蔗； MYB2 基因； 电子克隆； 生物信息学 中图分类号： Q785 文献标识码： A 文章编号： 1672 － 5565（ 2011） － 01 － 024 － 04
Байду номын сангаас
第1 期
李国印，等：甘蔗 MYB2 转录因子的电子克隆和生物信息学分析
25
1 材料和方法
1． 1 电子克隆获得新基因序列 以玉米 （ Zea mays） MYB2 转录因子基因（ Gene
Id： 732760） 作为探针，利用 NCBI 中的 tblastn 工具， 搜索甘蔗 EST 数据库，得到具有同源性的甘蔗 EST 序列，在 拼 接 的 基 础 上，以 拼 接 好 的 EST 拼 接 群 （ Contig） 为新探针，在甘蔗 EST 数据库里 重 新 搜 索，直到没有新的甘蔗 EST 可供拼接为止。将人工 拼接完成的新基因序列在非冗余数据库中进行搜 索，确认为新基因序列。 1． 2 生物信息学分析
以 NCBI 数据库为基础，电子克隆得到甘蔗中 编码 MYB2 的 cDNA 序列，利用生物信息学方法，对 该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、疏水性、 亚细胞定位及结构功能等方面进行预测和分析，为 后续通过实验手段克隆甘蔗 MYB2 基因和基因功能 研究奠定基础。
收稿日期： 2010 － 04 － 29； 修回日期： 2010 － 09 － 06． 基金项目： 国家 948 项目（ 2010 － C21） 。 作者简介： 李国印，男，山东菏泽，硕士研究生 E － mail： lyion029@ 163． com． * 通讯作者： 许莉萍，女，福建莆田，博士，博导、研究员，E － mail： xlpmail@ yahoo． com． cn．
通过软件 psort 预测，结果显示定位在 细胞膜的可能性最大，为 95． 5% ，而定位在细 胞质和细胞壁的可能性分别只有 3． 2% 和 1． 2% ，所 以，推测甘蔗 MYB2 蛋白是定位于细胞膜。 2． 6 甘蔗 MYB2 蛋白的二级结构预测分析 通过 SOPMA 方法，对甘蔗 MYB2 蛋白二级结构 进行预测，结果如图 4。该蛋白二级结构预测的分析 结果见表 1。可以看出，α 螺旋占的比例最高，为 44． 97% ，其次是无规则卷曲，而 β 折叠和延伸链所占的 比例低，分别只有 9． 52% 和 5． 29% 。）
2． 2 甘蔗 MYB2 基因编码氨基酸的一级结构预测 经预测，甘蔗 MYB2 基因编码氨基酸的一级结
构如下： 编码的氨基酸数： 189 等电点（ PI） ： 8． 88 分子量（ MW） ： 21144． 1 负电荷残基（ Asp + Glu） ： 20 正电荷残基（ Arg + Lys） ： 24 分子式： C926H1480N280O272S8 不稳定系数（ II） ： 43． 49 平均疏水性（ GRAVY） ： － 0． 436 脂肪系数（ AI） ： 88． 36
Id： 732760） 作为探针，利用 NCBI 中的甘蔗 EST 数 据库进行 BLAST 搜索，得到两个高度同源的 EST 序列 CA168157 和 CA207162。进一步通过 DNAstar 进行拼接，获得一个全长为 991 bp 的 cDNA 序列。 通过 ORF Finder 分析可知，该 cDNA 序列包含 570 bp 的完整开放阅读框，编码 189 个氨基酸，见图 1。
officinarummyb2proteinfunctionalcategory功能类别proboddsaminoacidbiosynthesis氨基酸生物合成biosynthesisofcofactors生物合成的辅因子cellenvelope细胞外被膜cellularprocesses细胞加工centralintermediarymetabolism中间代谢energymetabolism能量代谢fattyacidmetabolism脂肪酸代谢purinesandpyrimidines嘌呤嘧啶regulatoryfunctions调控replicationandtranscription转录复制translation转录transportandbinding转运结合00310045007900270049002800200115025503530271001814050619129903730771031715720475158213176150004428甘蔗myb2蛋白结构域三维结构预测利用expasy服务器的3djigsaw工具预测蛋白质的三维结构利用discoverystudioviewerpro软件查看预测结果如图6可知甘蔗myb2蛋白空间结构主要由6个螺旋和一些转角构成
图 2 甘蔗 MYB2 信号肽预测 Fig． 2 The Signal P － NN prediction for MYB2 of S． officinarum
注： C score： 原始剪切位点的分值； S score： 信号肽的分值； Y score： 综合剪切位点的分值
2． 4 甘蔗 MYB2 蛋白疏水性 / 亲水性分析 用 ProtScale 对甘蔗 MYB2 基因编码的氨基酸
（ Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement ，Ministry of Agriculture，Fujian Agriculture＆Forestry University，Fuzhou 350002，China）
Abstract： An novel MYB2 gene from Saccharum officinarum was cloned in silico based on the EST seqences from Unigene of NCBI． Some characters of the MYB2 encodes amino acid were analyzed and predicted by the tools of bioinformatics in the following aspects，including the compositon of amino acid sequence，hydrophobicity or hydrophilicity，secondary and tertiary structure of protein and funcion． Bioinformatical analysis showed that the full － length of MYB2 gene from S． officinarum was 991 bp and it contained a complete ORF which encoded 189 amino acid． The MYB2 gene contained an typical MYB domain and was highly conservative compared with MYB2 from several different plant species in sequence compositon，advanced structure and activity sites． The results will provide the basis for MYB2 gene cloning in experiment． Key words： Saccharum officinarum ，MYB2 gene，In silico cloning ，Bioinformatics
序列的疏水性 / 亲水性进行预测，结果如图 3。
图 1 电子克隆获得的甘蔗 MYB2 基因 cDNA 序列 及其推导的氨基酸序列（ * 表示终止密码子）
Fig． 1 The nucletide acid sequence and deduced amino acid sequence for MYB2 Gene of S． officinarum obtained by in silico cloning Stop codon is indicated by asterisk（ * ）
图 3 甘蔗 MYB2 氨基酸 疏水性 / 亲水性进行预测 Fig． 3 Predicted hydrophobicity / hydrophilicity of the sequence
of MYB2 deduced amino acid from S． officinarum
26
生物信息学
第9 卷
2． 3 甘蔗 MYB2 信号肽预测和分析 采用 SignalP3． 0Server 预测甘蔗 MYB2 的信号
肽，结果如图 2。根据图 2 的预测结果，MYB2 基因 所编码的蛋白不存在信号肽，为非分泌蛋白，该蛋白 在细胞质中合成后，不进行蛋白转运。
2 结果与分析
2． 1 新基因的识别 以玉米（ Zea mays） MYB2 转录因子基因（ Gene
第9卷 第1期 2 011 年3 月
生物信息学 China Journal of Bioinformatics
doi： 10. 3969 / j． issn． 1672 － 5565． 2011． 01． 006
Vol． 9 No． 1 Mar． ，2011
甘蔗 MYB2 转录因子的电子克隆和生物信息学分析
表 1 甘蔗 MYB2 蛋白的二级结构预测分析 Table 1 The analysis of secondary structure prediction
图 4 预测的甘蔗 MYB2 蛋白二级结构 Fig． 4 Predicted secondary structure of MYB2 protein from S． officinarum
注： Helix ： Alpha helix （ α 螺旋） Sheet： Extended strand （ 延伸链） Turn： Beta turn （ β 折叠） Coil： Random coil（ 无规则卷曲）
Electronic cloning and characterization of MYB2 gene from Saccharum officinarum using bioinformatics tools
LI Guo-yin ，QUE You-xiong，XU Li-ping* ，GUO Jin-long，YAN Xue-bing，CHEN Ru-kai
在植物中首先从玉米中克隆了含有 MYB 结构 域的 转 录 因 子 C1 基 因［1］，此 后 在 植 物 中 发 现 的 MYB 相关基因的数量迅速增加。对其功能的研究 表明，植物 MYB 转录因子具有广泛的生理功能，几 乎参与植物发育和代谢的各个方面，重点是调控环 境胁迫，如干旱和病害逆境胁迫、次生代谢调节、激 素调控应答及控制细胞分化等。
图 3 显示，多肽链的第 181 号的亮氨酸基（ Leu） 具有最高的分值 2． 256，疏水性最强； 第 16 号的甘氨 酸（ Gly） 具有最低的分值 － 2． 45，其次是第 103 号的 酪氨酸（ Tyr） ，为 － 2． 18，均属于亲水性氨基酸。进 一步 比 较 玉 米 （ Gene Id： 732760 ） 、小 麦 （ GeneID： 543160） 和拟南芥（ GeneID： 819332） 中的 MYB2 多肽 链的亲水性和疏水性，其结果均显示亲水特性。由此 预测甘蔗 MYB2 蛋白属于亲水性蛋白。 2． 5 甘蔗 MYB2 蛋白的亚细胞定位
植物 MYB2 转录因子是 MYB 大家族中一个小 的亚族，虽然不同植物的 MYB2 基因具有不同的生 物 学 功 能［2，3］，但 它 们 都 是 在 转 录 水 平 上 调 控 植 物
各个阶段的生长发育。通过突变体及基因敲除技 术，已克隆了很多植物 MYB 类基因，但在甘蔗 MYB 方面研究甚少。
李国印，阙友雄，许莉萍* ，郭晋隆，闫学兵，陈如凯
（ 福建农林大学 农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室，福建 福州 350002）
摘 要： 用电子克隆方法获得甘蔗 MYB2 基因，采用生物信息学方法，对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构 域、疏水性 / 亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明： 甘蔗 MYB2 基因全长 991 bp，包含 570 bp 的 ORF，编码 189 个氨基酸。甘蔗 MYB2 基因包含有 MYB 功能域，在序列组成、高级结构及活性位点等方面，与玉米等 其它植物的 MYB2 基因具有高度的相似性。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。 关键词： 甘蔗； MYB2 基因； 电子克隆； 生物信息学 中图分类号： Q785 文献标识码： A 文章编号： 1672 － 5565（ 2011） － 01 － 024 － 04
Байду номын сангаас
第1 期
李国印，等：甘蔗 MYB2 转录因子的电子克隆和生物信息学分析
25
1 材料和方法
1． 1 电子克隆获得新基因序列 以玉米 （ Zea mays） MYB2 转录因子基因（ Gene
Id： 732760） 作为探针，利用 NCBI 中的 tblastn 工具， 搜索甘蔗 EST 数据库，得到具有同源性的甘蔗 EST 序列，在 拼 接 的 基 础 上，以 拼 接 好 的 EST 拼 接 群 （ Contig） 为新探针，在甘蔗 EST 数据库里 重 新 搜 索，直到没有新的甘蔗 EST 可供拼接为止。将人工 拼接完成的新基因序列在非冗余数据库中进行搜 索，确认为新基因序列。 1． 2 生物信息学分析
以 NCBI 数据库为基础，电子克隆得到甘蔗中 编码 MYB2 的 cDNA 序列，利用生物信息学方法，对 该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、疏水性、 亚细胞定位及结构功能等方面进行预测和分析，为 后续通过实验手段克隆甘蔗 MYB2 基因和基因功能 研究奠定基础。
收稿日期： 2010 － 04 － 29； 修回日期： 2010 － 09 － 06． 基金项目： 国家 948 项目（ 2010 － C21） 。 作者简介： 李国印，男，山东菏泽，硕士研究生 E － mail： lyion029@ 163． com． * 通讯作者： 许莉萍，女，福建莆田，博士，博导、研究员，E － mail： xlpmail@ yahoo． com． cn．
通过软件 psort 预测，结果显示定位在 细胞膜的可能性最大，为 95． 5% ，而定位在细 胞质和细胞壁的可能性分别只有 3． 2% 和 1． 2% ，所 以，推测甘蔗 MYB2 蛋白是定位于细胞膜。 2． 6 甘蔗 MYB2 蛋白的二级结构预测分析 通过 SOPMA 方法，对甘蔗 MYB2 蛋白二级结构 进行预测，结果如图 4。该蛋白二级结构预测的分析 结果见表 1。可以看出，α 螺旋占的比例最高，为 44． 97% ，其次是无规则卷曲，而 β 折叠和延伸链所占的 比例低，分别只有 9． 52% 和 5． 29% 。）
2． 2 甘蔗 MYB2 基因编码氨基酸的一级结构预测 经预测，甘蔗 MYB2 基因编码氨基酸的一级结
构如下： 编码的氨基酸数： 189 等电点（ PI） ： 8． 88 分子量（ MW） ： 21144． 1 负电荷残基（ Asp + Glu） ： 20 正电荷残基（ Arg + Lys） ： 24 分子式： C926H1480N280O272S8 不稳定系数（ II） ： 43． 49 平均疏水性（ GRAVY） ： － 0． 436 脂肪系数（ AI） ： 88． 36
Id： 732760） 作为探针，利用 NCBI 中的甘蔗 EST 数 据库进行 BLAST 搜索，得到两个高度同源的 EST 序列 CA168157 和 CA207162。进一步通过 DNAstar 进行拼接，获得一个全长为 991 bp 的 cDNA 序列。 通过 ORF Finder 分析可知，该 cDNA 序列包含 570 bp 的完整开放阅读框，编码 189 个氨基酸，见图 1。
officinarummyb2proteinfunctionalcategory功能类别proboddsaminoacidbiosynthesis氨基酸生物合成biosynthesisofcofactors生物合成的辅因子cellenvelope细胞外被膜cellularprocesses细胞加工centralintermediarymetabolism中间代谢energymetabolism能量代谢fattyacidmetabolism脂肪酸代谢purinesandpyrimidines嘌呤嘧啶regulatoryfunctions调控replicationandtranscription转录复制translation转录transportandbinding转运结合00310045007900270049002800200115025503530271001814050619129903730771031715720475158213176150004428甘蔗myb2蛋白结构域三维结构预测利用expasy服务器的3djigsaw工具预测蛋白质的三维结构利用discoverystudioviewerpro软件查看预测结果如图6可知甘蔗myb2蛋白空间结构主要由6个螺旋和一些转角构成
图 2 甘蔗 MYB2 信号肽预测 Fig． 2 The Signal P － NN prediction for MYB2 of S． officinarum
注： C score： 原始剪切位点的分值； S score： 信号肽的分值； Y score： 综合剪切位点的分值
2． 4 甘蔗 MYB2 蛋白疏水性 / 亲水性分析 用 ProtScale 对甘蔗 MYB2 基因编码的氨基酸
（ Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement ，Ministry of Agriculture，Fujian Agriculture＆Forestry University，Fuzhou 350002，China）
Abstract： An novel MYB2 gene from Saccharum officinarum was cloned in silico based on the EST seqences from Unigene of NCBI． Some characters of the MYB2 encodes amino acid were analyzed and predicted by the tools of bioinformatics in the following aspects，including the compositon of amino acid sequence，hydrophobicity or hydrophilicity，secondary and tertiary structure of protein and funcion． Bioinformatical analysis showed that the full － length of MYB2 gene from S． officinarum was 991 bp and it contained a complete ORF which encoded 189 amino acid． The MYB2 gene contained an typical MYB domain and was highly conservative compared with MYB2 from several different plant species in sequence compositon，advanced structure and activity sites． The results will provide the basis for MYB2 gene cloning in experiment． Key words： Saccharum officinarum ，MYB2 gene，In silico cloning ，Bioinformatics
序列的疏水性 / 亲水性进行预测，结果如图 3。
图 1 电子克隆获得的甘蔗 MYB2 基因 cDNA 序列 及其推导的氨基酸序列（ * 表示终止密码子）
Fig． 1 The nucletide acid sequence and deduced amino acid sequence for MYB2 Gene of S． officinarum obtained by in silico cloning Stop codon is indicated by asterisk（ * ）
图 3 甘蔗 MYB2 氨基酸 疏水性 / 亲水性进行预测 Fig． 3 Predicted hydrophobicity / hydrophilicity of the sequence
of MYB2 deduced amino acid from S． officinarum
26
生物信息学
第9 卷
2． 3 甘蔗 MYB2 信号肽预测和分析 采用 SignalP3． 0Server 预测甘蔗 MYB2 的信号
肽，结果如图 2。根据图 2 的预测结果，MYB2 基因 所编码的蛋白不存在信号肽，为非分泌蛋白，该蛋白 在细胞质中合成后，不进行蛋白转运。
2 结果与分析
2． 1 新基因的识别 以玉米（ Zea mays） MYB2 转录因子基因（ Gene
第9卷 第1期 2 011 年3 月
生物信息学 China Journal of Bioinformatics
doi： 10. 3969 / j． issn． 1672 － 5565． 2011． 01． 006
Vol． 9 No． 1 Mar． ，2011
甘蔗 MYB2 转录因子的电子克隆和生物信息学分析
表 1 甘蔗 MYB2 蛋白的二级结构预测分析 Table 1 The analysis of secondary structure prediction
图 4 预测的甘蔗 MYB2 蛋白二级结构 Fig． 4 Predicted secondary structure of MYB2 protein from S． officinarum
注： Helix ： Alpha helix （ α 螺旋） Sheet： Extended strand （ 延伸链） Turn： Beta turn （ β 折叠） Coil： Random coil（ 无规则卷曲）
Electronic cloning and characterization of MYB2 gene from Saccharum officinarum using bioinformatics tools
LI Guo-yin ，QUE You-xiong，XU Li-ping* ，GUO Jin-long，YAN Xue-bing，CHEN Ru-kai
在植物中首先从玉米中克隆了含有 MYB 结构 域的 转 录 因 子 C1 基 因［1］，此 后 在 植 物 中 发 现 的 MYB 相关基因的数量迅速增加。对其功能的研究 表明，植物 MYB 转录因子具有广泛的生理功能，几 乎参与植物发育和代谢的各个方面，重点是调控环 境胁迫，如干旱和病害逆境胁迫、次生代谢调节、激 素调控应答及控制细胞分化等。