抗生素-过氧乙酸对甲状腺去细胞生物支架消毒效果评价

CHINESE JOURNAL OF ANATOMY V ol.42 No.5 2019 解剖学杂志 2019年第42卷第5期
抗生素-过氧乙酸对甲状腺去细胞生物支架消毒效果评价*
齐艳红1 周小明2 黄涛涛3 万新龙4 王 鹏2 王志翊1，2，4 陈 婵5 翁 杰1△
（温州医科大学，1附属第二医院急诊医学科，2附属第二医院全科医学科，3第二临床医学院临床医学系，
4基础医学院生物支架移植与免疫研究所，5附属第一医院老年医学科，温州 325000）摘要 目的： 采用抗生素-过氧乙酸两步消毒法对甲状腺去细胞支架进行消毒并对其评价。

方法：震荡法制备兔甲状腺去细胞生物支架，分别采用PBS 、抗生素及抗生素-过氧乙酸处理去细胞支架，观察处理后支架的三维结构、细胞毒性以及微生物含量。

结果：
H-E 染色和电镜扫描提示3组支架结构无破坏，三维空间结构完整；CCK-8检测提示处理后3组支架无细胞毒性，3组间差异无统计学意义；微生物定量检测分析提示抗生素-过氧乙酸组支架内微生物含量为0 CFU/g ，显著低于抗生素组3.45 ×103 （
2.4×103～4.7×103）CFU/g 和正常对照组2.30 ×108 CFU/g （0.9×108～4.1×108）
，3组间微生物含量有显著性差异。

结论 ：抗生素-过氧乙酸两步法成功对甲状腺去细胞生物支架进行消毒、灭菌，方法简便、有效，灭菌后支架无毒性残留及结构破坏。

关键词 甲状腺去细胞支架；消毒；抗生素；过氧乙酸；菌落形成单位法
Evaluation of the antibiotics-peracetic acid sterilization method
for decellularized thyroid gland scaffolds *
Qi Yanhong 1，Zhou Xiaoming 2，Huang Taotao 3，Wan Xinlong 4，Wang Peng 2，
Wang Zhiyi 1，2，4，Chen Chan 5，Weng Jie
1△
（1. Department of Emergency Medicine ，2. Department of General Practice ，Second Affiliated Hospital ；3. Second Clinical Medical College ，4. Institute of Bioscaffold Transplantation and Immunology ，5. Department of Geriatric
Medicine ，First Affiliated Hospital ，Wenzhou Medical University ，Wenzhou 325000，China ）
Abstract Objective ：To investigate the efficiency of a two-step antibiotics and peracetic acid sterilization method on thyroid gland decellularized biologic scaffolds and to provide experimental data for decellularized thyroid gland scaffolds transplantation. Methods ：Thyroid gland decullularized biologic scaffolds were prepared by soaking with rotating and sterilized by PBS ，antibiotics ，antibiotics-peracetic acid respectively. The three-dimensional structure ，cytotoxicity and bacterial bioburden of decellularized biologic scaffolds were observed after disinfection treatment. Results ：The H-E staining and scanning electron microscopy showed the three-dimensional structure was preserved well in three groups. The CCK-8 detection showed there was no cytotoxicity in three groups. The absorbance values in three groups had no significant differences. Bacterial bioburden detection showed that antibiotics-peracetic acid decellularized scaffolds were sterile ，with a calculated bioburden of zero ，antibiotics decellularized scaffolds and PBS decellularized scaffolds were not sterile ，with a mean bioburden of 3.45×103 （
2.4×103-4.7×103） CFU/g and 2.30× 108 CFU/g （0.9×108-4.1×108）
respectively. There were significant differences in the three groups. Conclusion ：Antibiotic-peracetic acid sterilization method successfully disinfects and sterilizes the thyroid decellularized biological scaffold. The method is simple and effective ，and the scaffold has no toxicity residue and structural damage after sterilization.
Key words decellularized thyroid gland scaffold ；sterilization ；antibiotics ；peracetic acid ；colony forming unit
*国家自然科学基金（81772054，81701379）；浙江省自然科学基金（LQ17H010004）；温州市科技局资助项目（Y20160113）第1作者E-mail ：xiaoqi780704@
△
通信作者，E-mail ：wengjie198811@
收稿日期： 2018-11-16；修回日期：2019-05-24
doi ： 10.3969/j.issn.1001-1633.2019.05.006
·论 著·
架成为修复甲状腺功能最理想的生物材料。

甲状腺去细胞支架在体内移植前需要进行严格的灭菌消毒，同时不能破坏其生物学及力学性能。

当前有关去细胞支架的方法较多，如高压蒸汽灭菌、电离辐射（X 线、γ射线）、化学试剂（环氧乙烷、过氧乙酸）等[1-2]。

本研究采用抗生素-过氧乙酸两步消毒法处理甲状腺去细胞生物支架，对处理
我国每年有大量甲状腺癌患者被迫接受甲状腺全切术，随着组织工程学的发展，甲状腺去细胞支
后甲状腺去细胞支架进行评价，为甲状腺去细胞支架产品化奠定基础。

1 材料和方法
1.1 试剂和动物
十二烷基硫酸钠（SDS）、CCK-8试剂盒、抗生素（万古霉素、庆大霉素、头孢西丁、两性霉素B）及过氧乙酸均购于Sigma公司；人甲状腺滤泡上皮细胞购于上海中科院细胞库；新西兰大白兔购于温州医科大学实验动物中心，体质量2.5～3.0 kg。

1.2 甲状腺去细胞支架制备
新西兰大白兔麻醉固定后离体甲状腺组织，撕去表面被膜并用肝素生理盐水冲洗，将甲状腺组织浸泡于1 %的SDS的溶液后置于平板震荡器上震荡，震荡频率为120 r/min，连续震荡72 h，每6 h 换液1次；72 h后放入去离子水中继续震荡24 h，震荡频率为120 r/min，以清除残留SDS和DNA，每间隔6 h换液1次。

整个震荡过程处于37.0℃恒温中进行。

最后将甲状腺去细胞生物支架用PBS冲洗干净，4℃保存备用。

1.3 去细胞支架消毒分组
将甲状腺去细胞生物支架随机分为3组。

抗生素组：将去细胞支架放入抗生素混合液中（50 mg/L 万古霉素+8 mg /L庆大霉素+240 mg/L头孢西丁+ 25 mg/L两性霉素B）浸泡后置于平板振荡器中震荡（频率300 r/min，时间24 h），无菌PBS震荡清洗（频率300 r/min，时间12 h，3 h换液1次），4 ℃保存备用；抗生素-过氧乙酸组：将抗生素组支架放入0.1%过氧乙酸中浸泡后置于平板振荡器中震荡（频率300 r/min，时间3 h），无菌PBS震荡清洗（频率300 r/min，时间12 h，3 h换液1次），4 ℃保存备用；对照组：去细胞支架放入无菌PBS后置于平板振荡器中震荡（频率300 r/min，时间24 h，3 h 换液1次），4 ℃保存备用。

1.4 消毒后去细胞支架评价
1.4.1 H-E染色去细胞甲状腺生物支架多聚甲醛固定，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后切片，最后脱蜡、至水、染色。

1.4.2 扫描电镜去细胞甲状腺支架
2.5%的戊二醛固定24 h，锇酸固定后，丙酮梯度脱水，喷金，扫描电镜观察。

1.4.3 细胞毒性检测将3组支架按0.1 g/ml 置于培养液中，于37℃静置48 h制备浸提液。

将人甲状腺滤泡上皮细胞悬浮液转移至96孔板中（每孔100 μl）并分为对照组、抗生素组、抗生素-过氧乙酸组及空白组，分别加入3组支架浸提液10 μl，空白组加入10 μl PBS，分别培养24、48、72、96 h后使用CCK-8法测定吸光度（A值）；
1.4.4 微生物定量检测采用平板计数法（colony forming units，CFU），将甲状腺支架称重，用匀浆机研磨支架成粉末状后溶于1 ml无菌PBS中，上述整个过程均为无菌操作。

将得到的样品用PBS 连续稀释10次，并分成3份，以涂布法接种在琼脂平板上，放入细胞培养箱孵育72 h。

根据菌落数计算支架微生物含量。

1.5 统计学处理
采用SPSS 18.0 统计分析软件进行数据处理，组间采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 H-E染色和电镜扫描
正常甲状腺H-E染色可见圆形、类圆形甲状腺滤泡腔，滤泡边缘可见蓝色细胞核结构，正常对照组、抗生素组以及抗生素-过氧乙酸组甲状腺去细胞支架HE染色均可见滤泡腔结构，均未见明显的细胞核成分，未见支架结构破坏（图1 A～D）。

扫描电镜观察抗生素-过氧乙酸组去细胞支架与正常甲状腺无明显差异，两者三维空间结构均保存完好，未见明显胶原纤维断裂（图2 A、B）。

图1 甲状腺组织H-E染色，标尺=50 μm
Fig 1 H-E staining in thyroid gland tissue，bar=50 μm
A：Native thyroid gland；B：Control group；C：Antibiotics group；D：Antibiotics-peracetic group
A B C D
2.2 体外细胞毒性实验CCK-8法检测不同组不同时间段吸光度（A ）值见图3。

对照组、抗生素组及抗生素-过氧乙酸组在同一时间段A 值较空白组有下降趋势，但差异无统计学意义（P >0.05）；对照组、抗生素组及抗生素-过氧乙酸组分别在24、48、72、96 h 时A 值差异无统计学意义（P >0.05）。

胞生物支架被制备出[3-5]。

但是，去细胞支架相关的产品在临床应用中却不甚理想，其中，去细胞生物支架的灭菌、消毒成为支架体内移植前最关键的问题。

本研究采用抗生素-过氧乙酸两步消毒法对甲状腺去细胞支架进行消毒、灭菌，并对其有效性进行评估。

目前常用的支架消毒方法包括电离辐射和化学试剂（戊二醛、环氧乙烷、抗生素、过氧乙酸等）。

电离辐射消毒容易导致细胞外基质的交联和大分子链的断裂，从而破坏细胞外基质，而化学试剂消毒剂中戊二醛、环氧乙烷虽能有效杀灭病菌，但会在去细胞支架上残留高毒性产物[6]。

本研究中采用了包含万古霉素、头孢西丁、庆大霉素以及两性霉素B 的抗生素消毒液，这种抗生素组合方式可以对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、厌氧菌以及真菌具有良好的灭菌作用。

本研究结果显示抗生素消毒方案能够显著减少去细胞支架中微生物的含量，这与Germain 等[7]研究取得类似的结果。

虽然抗生素消毒方式能明显抑制细菌生长，但是本研究中微生物检测显示仍有较多的菌落被培养出。

可能因为细菌具有菌毛，增加了对支架的黏附能力[8]，导致抗生素很难完全清除去细胞支架里的细菌[9-10]。

同时由于抗生素对病毒和芽胞基本无效，而且存在抗生素对部分细菌耐药可能，因此单独采用抗生素灭菌方案仍会有部分病原菌在支架内存留，不能应用于临床。

过氧乙酸是杀菌能力较强的高效消毒剂，具有强氧化作用，对细菌、病毒、真菌和芽孢均能迅速杀灭。

商业化的过氧乙酸试剂已经应用于去细胞生物支架的消毒[11-12]。

但有研究报道，单独采用过氧乙酸对支架消毒并不能完全清除支架内微生物[13]。

因此本研究对甲状腺支架采用“两步法”消毒，第一步抗生素震荡浸泡消毒处理24 h ，第二步采用0.1%过氧乙酸震荡浸泡3 h 。

微生物检测分析提示，
图2 正常甲状腺组织（A ）和抗生素-过氧乙酸组甲状腺支架（B ）扫描电镜观察，标尺=50 μm
Fig 2 Scanning electron microscopy of normal thyraid gland tissue （A ）and antibiotics-peracetic decellularized scaffold （B ），bar=50 μm
A
B
图3 CCK-8 法检测不同组不同时间段甲状腺
滤泡上皮细胞吸光度A 值
Fig 3 Absorbance values of thyroid follicular epithelial cells in each group tested by CCK-8 assay at different time points
A v a l u e
2.52.01.51.00.50.0
Blank group
Control group Antibiotics group
Antibiotics-peracetic group
24 h 48 h 72 h 96 h
2.3 微生物定量检测
正常甲状腺组织孵育的琼脂平板内可见大量菌落生长，平均微生物含量为2.30×108 CFU/g （0.9× 108～4.1×108）；抗生素组甲状腺支架孵育的琼脂平板内可见少许菌落生长，平均微生物含量为3.45×103 CFU/g （2.4×103～4.7×103）；抗生素-过氧乙酸组甲状腺支架孵育的琼脂平板内未见菌落生长，平均微生物含量为0 CFU/g 。

3组间微生物含量比较有差异有统计学意义（P <0.05）。

3 讨论
目前随着去细胞技术的发展，越来越多的去细
50 μm
50 μm
经“两步法”消毒后甲状腺支架内无病原微生物生长。

Fidalgo等[2]采用抗生素-过氧乙酸两步消毒法对猪和牛去细胞心包支架进行消毒，经检测支架内均无病原微生物检出，为临床去细胞心包支架移植提供了简便、有效的消毒方案，本研究也同样取得了类似的结果。

应用化学消毒剂存在的问题是去细胞支架可能存在有毒化学物质残留。

本研究采用CCK-8细胞毒性检测“两步法”消毒后去细胞支架毒性，与对照组、抗生素组无显著性差异，提示过氧乙酸对细胞无毒性作用。

研究表明支架内残留少量的过氧乙酸是无毒性的，残留的过氧乙酸也将快速分解为水、氧和二氧化碳，进一步增加了过氧乙酸作为甲状腺去细胞支架消毒剂的安全性能。

由于过氧乙酸具有腐蚀性，作为消毒剂使用时均需要经过一定程度的稀释。

研究表明，采用0.1%过氧乙酸对去细胞支架进行消毒处理均未显示支架形态和生物力学性能改变[2，14]。

本研究同样采用0.1%过氧乙酸对甲状腺去细胞支架进行消毒处理，经H-E染色和扫描电镜观察支架三维空间结构均保存完好，无明显胶原纤维断裂，提示0.1%的过氧乙酸对甲状腺去细胞生物支架无明显破坏作用。

本研究采用抗生素联合0.1%过氧乙酸两步法成功对甲状腺去细胞生物支架进行消毒、灭菌，灭菌后支架无毒性残留及结构破坏，方法简便、有效，并为其他去细胞生物支架消毒提供了思路。

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