环境毒理学常用实验方法

<1 1～ 50～ 500～ 50000～
<10 10～ 100～ 1000～ 10000～
兔经皮 LD50 （mg/kg）
<5 5～ 44～ 350～ 2180～
对人可能致死的估剂量
⑴g/kg 体重 ⑵g/60kg 体重
<0.05 0.05～ 0.5～ 5.0～
<0.1 3.0 30.0 250.0
計算公式
LogLD50=Xm-i(∑P-0.5)
式中Xm—最大劑量的對數值 i—相鄰劑量比值的對數 ∑P—各組死亡率的總和（以小數
表示）
急性毒性分級
為了粗略表示外源化學物急性毒性的強弱 和其對人的潛在危害程度，國際上提出了 外源化學物的急性毒性分級（acute toxicity classification）。但分級標準並 未完全統一
>15.0 >1000.0
LD50影響因素
試驗動物的內外環境各種因素的影響 試驗人員操作熟練程度 受試化學物的濃度或稀釋倍數的影響 同一外源化學物在同一品系動物和同樣
接觸途徑所測定的LD50值也會有一定差 異，甚至可有2～3倍的波動範圍
急性毒作用帶(acute effect zone，Zac)
Zac =
描述性動物實驗研究採用的體外試驗研究的模 型標本包括某些離體臟器、組織切片、原代細 胞、傳代培養細胞、組織勻漿、亞細胞組分， 甚至昆蟲、細菌等
染毒途徑和方式
經口染毒 經呼吸道染毒 經皮膚染毒 其他途徑染毒
經口染毒
➢灌胃 ➢喂飼 ➢吞咽膠囊
灌胃
❖人工給實驗動物灌入外源化學物是經常使用 的經口染毒方法。此時外源化學物直接灌入 胃內，而不與口腔及食道接觸，故而給予的 化學物劑量準確。但是，當待測化學物為氣 態或固體時均需用某種溶劑溶解，液態化學 物往往也需用溶劑溶解
為LD兩5大0值類的，計其算一有是多死種亡方率法—，劑大量體反上應可相以關歸要納 求為正態分配的，其中概率單位圖解法和寇 氏法(Karber)較為常用。另一類是不要求為 正態分佈的（非正態分佈），計算時只查對 有關表格即可得到LD50
寇氏法
此法計算LD50較為簡便，但實驗要符合下列條 件： 各個實驗組動物數相同 各組劑量要按等比級數分組 最大劑量的死亡率最好為100%或與之接近， 最小劑量的死亡率為0%或與之接近
非致死性急性毒性試驗要求測定急性毒作用閾 （Limac）。 毒性效應是一種或多種毒性症狀或生
理生化指標改變。對於某些生理生化的改變，如體 重、體力或酶活性等， Limac是指均值與對照組比 較時，其差異有統計學意義的最低劑量 非致死性急性毒性實驗觀察效應很多，首先明確觀 察效應
第二節 蓄積性毒性試驗
非致死性急性毒性
為了克服致死性急性毒性只能提供死亡指標這 一缺點，非致死性急性毒性的概念顯得比較重 要，它可提供常規的非致死急性中毒的安全界 限和對急性中毒的危險性估計
LD50的測定
有測時定需LD選50用常其選他用種成屬年。小無鼠特和殊大要鼠求兩，個雌種雄屬兩， 性各半
正式試驗時一般每組10只動物，在預測的 LD100及LD0之間安排5～7個劑量組
喂飼法的優點是接觸化學物的方式符合人類接 觸污染食物與水的方式,方法簡便、易操作。但 往往攝入的化學物量不准確，僅適用於動物數 量較大的毒理學實驗
由於此種方法更適宜進行多日染毒，急性毒性 試驗一般不用之
吞咽膠囊
將所需劑量的受試化學物裝入藥用 膠囊內，強制放到動物的舌後咽部 迫使其咽下。此法劑量準確，尤其 適用於易揮發、易水解和有異臭的 化學物。兔、貓及狗等較大動物可 用此法
LD50
Limac 式中：LD50代表毒性上限，Limac 急性閾劑量代 表毒性下限。
Zac值的大小可反映急性閾劑量距離LD50的寬窄。 Zac值越大表明化合物引起急性死亡的危險性越小， 反之表明引起急性死亡的危險性越大
非致死性急性毒性
急性毒性只能提供死亡指標，非致死性急性毒性可 提供常規的非致死急性中毒的安全界限和對急性中 毒的危險性估計
經呼吸道染毒
凡是氣態或易揮發的液態化學物均有經呼吸道吸入 的可能，在生產過程中形成氣溶膠的化學物也可經 呼吸道吸入
經呼吸道染毒有兩種類型
➢ 動物自行吸收
✓ 靜式吸入染毒
✓ 動式吸入染毒
➢ 人工動物氣管注入
將液態或固態外源化學物注入肺內。這是一個手術 過程，僅適用於製造化學物對肺臟損傷模型的製備， 而不用於一般毒性研究
當外源化學物毒性過低，或一次染毒劑量受機體容量 限制，需給予實驗動物較大劑量時，則可在24h內分 次染毒，即為“多次”。“短期內”，一般限定為7 天內。
急性毒性中毒症狀與化學性質和染 毒劑量的關係
實驗動物接觸外源化學物所引發的急性毒 性效應出現的快慢和毒性反應的強度， 因外源化學物的性質（主要為化學結構 與理化性質）和染毒劑量的大小而有很 大差別。有的化學物在實驗動物接觸致 死劑量後，幾分鐘之內即可產生中毒症 狀，甚至瞬間死亡，有的化學物則在接 觸致死劑量幾天才出現明顯的中毒症狀 或死亡
經皮膚染毒
研究外源化學物的經皮吸收時，皮膚 接觸化學物的面積、時間長短、環境 中溫、濕度均應控制統一的條件
為保證不因皮膚部位不同而形成的化 學物滲透率差異，一般大鼠、豚鼠、 兔均使用背部皮膚
其他途徑染毒
有時需對外源化學物進行絕對毒性或 比較毒性研究，或進行一些必要的特 殊研究(如靜脈注射毒物動力學、代謝 研究、急救藥物篩選等)，往往用注射 途徑染毒
1001～10000
50;50000
兔经皮 LD50（mg/kg）
<10
11～50 51～500 501～5000 >5000
WHO推薦的外源化學物急性毒性五級分級標 準
毒性分级
剧毒 高毒 中等毒 低毒 微毒
大鼠一次经口 6 只大鼠吸入 4h，死亡 LD50（mg/kg） 2-4 只的浓度（ppm）
蓄積毒性（cumulative toxicity）
蓄積毒性是指低於一次中毒劑量的外源化學物， 反復與機體接觸一定時間後致使機體出現的中毒 作用
一種外源化學物在體內蓄積作用的過程，表現為 物質蓄積和功能蓄積。物質蓄積和功能蓄積往往 是同時存在又互為基礎，在實際工作中常難於嚴 格區別
外源化學物在機體內所產生的蓄積作用是引起亞 慢性毒性作用和慢性毒性作用的基礎
急性毒性試驗的目的
急性毒性研究的目的，主要是探 求化學物的致死劑量，以初步評 估其對人類的可能毒害的危險性。 再者是求該化學物的劑量-反應 關係，為其他毒性實驗打下選擇 染毒劑量的基礎
化學物質的急性毒性分級
毒性分 級
大鼠一次 經口
LD50 （mg/kg）
6只大鼠吸 入4h死亡 2～4只的
濃度 （ppm）
受試物的蓄積毒性強弱是評估它的毒性作用指標 之一，也是制定衛生標準時選用安全係數大小的 重要參考依據
物質蓄積
物質蓄積指外源化學物反復進入機體內， 在體內的吸收量大於排出量，並在體內逐 漸積累的過程
物質蓄積可以用化學方法測得機體內(或某 些組織臟器內)存在該化學物母體或其代謝 產物，例如重金屬鉛、汞、錳等，又如 DDT代謝物
實驗動物的選擇
毒理學中研究外源化學物的基礎毒性主要是進 行體內試驗，即是以實驗動物為研究對象，最 終向外源化學物毒害主體—人類外推
不同種屬的動物對同一受試物的毒性作用表現 可有很大的差別，要獲得較可靠的實驗結果， 一般應選用兩種以上的實驗動物。常選用大白 鼠和小白鼠。根據不同實驗目的，可選用不同 實驗動物
功能蓄積
功能蓄積指不斷進入機體的外源化 學物，對機體反復作用並引起功能 發生改變累積加重，最後導致出現 損害作用的過程。功能蓄積往往測 不出該物質，如某些有機溶劑、有 機磷化合物等
評價毒物蓄積性的方法
※蓄積係數法 ☆固定劑量法 ☆遞增劑量法
※生物半減期法 ※蓄積率測定法
蓄積係數法
蓄積係數是指多次染毒使半數動物出現毒性效 應的總有效劑量(ED50（n）或LD50（n)與一次染 毒的半數有效量（ED50（1）或LD50 （1） ）之比 值，毒性效應包括死亡
❖灌胃體積依所用實驗動物而定，小鼠一次灌 胃體積在0.1～0.5ml/kg體重，大鼠在 1.0ml/100g體重之內，家兔在5ml/kg體重 之內，狗不超過50ml/10kg體重
喂飼
喂飼方法染毒是將化學物溶於無害的溶液中拌 入飼料或飲用水中，使動物自行攝入含化學物 的飼料或水，然後依每日食入的飼料與水在推 算動物實際攝入化學物的劑量
我國目前除參考使用國際上幾種分級標準 之外，又於1978年提出了相應的暫行標
無論我國或國際上急性分級標準都還存在 著不少缺點，有待逐步改進
農藥的急性毒性分級
级别
剧毒 高毒 中等毒 低毒
大 鼠 经 口 LD50 大 鼠 经 皮 LD50 大 鼠 吸 入 LC50
（mg/kg）
（mg/kg· 4h）
（mg/m3）2h
注射途徑包括靜脈注射(大鼠、小鼠 尾靜脈，兔耳緣靜脈)、肌肉注射、皮 下注射及小動物腹腔注射染毒。但注 射時應控制注射體積
毒性反應的觀察與檢查
根據急性毒性試驗的目的，受試動物給 予受試物後，應即刻密切觀察各組動物 發生的毒性反應（全身的或局部的）情 況，中毒症狀的特點和出現時間，中毒 症狀恢復時間，動物發生中毒死亡的時 間及死亡數，死亡動物必須的病理解剖 檢查觀察等
毒物蓄積性的定義
外源化學物進人機體後，經過代謝轉化以後 代謝產物或者以未經代謝轉化的原形母體化 學物排出體外。但是當化學物反復多次染毒 動物，而且化學物進入機體的速度或總量超 過代謝轉化的速度與排出機體的速度或總量 時，化學物或其代謝產物就可能在機體內逐 漸增加並貯留某些部位。這種現象就稱為化 學物的蓄積作用(cumulation)，大多數蓄 積作用會產生蓄積毒性
環境毒理學常用實驗方法
第一節 急性毒性試驗
急性毒性
➢ 急性毒性(acute toxicity)是指機體(人或實驗動物) 一次或24h之內多次接觸(染毒)外源化學物之後，在 短期內所發生的毒性效應，包括引起死亡效應
➢ 所謂“一次或24內多次”接觸或染毒的時間界定
一次是指瞬間染毒，如經口染毒、經注射途徑染毒， 但在經呼吸道與經皮膚染毒，則是指在一個特定的期 間內持續地接觸化學物的過程，所以“一次”含有時 間因素
蓄積毒性分級
Kcum
蓄積毒性強度
﹤1 1～ 3～ 5～
高度蓄積 明顯蓄積 中等蓄積 輕度蓄積
固定劑量法
➢取大鼠或小鼠，以灌胃或腹腔注射給予受試 化學物。先求其LD50，再以相同條件將40 只或以上動物，雌雄各半，均分兩組，一為 染毒組，一為對照組
➢對受試動物按1/10～1/20 ED50（1）（LD50 （1））的固定劑量，連續每天進行染毒一次， 觀察記錄受試動物出現的某種毒性效應或反 應情況
試驗的觀察期限，如受試動物於接觸受 試物後24～48h內中毒死亡，未發現有 遲發中毒作用時，一般觀察7～14d 即 可
急性毒性常用指標
急性致死毒性最常用的指標
是LD50，它是經過統計處理計算得出的數值， 與LD100、LD0等相比有更高的重現性 L半D5的0表劑示量一(或種濃外度源）化學物引起實驗動物死亡一
<5
<20
<20
5
20
20
50～500
200～2000
200～2000
>500
>2000
>2000
工業毒物急性毒性分級標準
毒性分级
剧毒 高毒 中等毒 低毒 微毒
小 鼠 一 次经 口 LD50 小鼠吸入 2hLC50（ppm） （ mg/k g）
<10
11～100
<50
51～500
101～1000
501～5000
蓄積係數法的原理是在一定期限內, 以低於致死 劑量(＜LD50)的劑量，每日給實驗動物染毒， 直至出現預計的毒性效應(如半數動物死亡)為止， 然後計算蓄積係數(cumulative coefficient,Kcum)
半指數 某有 一效 物量 質（ 使m50e%d的ia試ef驗fe動ct物iv產e d生o效se應, E的D劑50量）
兔塗皮時 LD50
（mg/kg）
對人可能致死量
（g/kg） 總量（g） （60kg體 重）
劇毒 高毒 中等毒 低毒 微毒
＜1
1505005000-
＜10
10100100010000-
＜5
5443502180-
＜0.05
0.050.55＞15
0.1
3 30 250 ＞ 1000
1ppm=1mg/kg=1mg/L=1×10-6 常用來表示氣體濃度，或者溶液濃度。