蛋白质含量的测定(一)——考马斯亮蓝染色法

考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量，属于染料结合法的



一种 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈棕红色，当它与蛋白质通过 疏水作用结合后变为蓝色，前者的最大光吸收在465nm，后 者在595nm 在一定蛋白质浓度范围内（0.01～1.0mg/mL），蛋白质-色素 结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合2min左右达到平衡，完成反应 十分迅速，其结合物在室温1h内保持稳定 考马斯亮蓝G-250染色法简单迅速，灵敏度高，一些阳离子如 K+、Na+、Mg2+、NH4+以及乙醇等物质都不干扰测定，但一 些去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定，且样品测定 后不能回收
常用的检测器有光电管、光电倍增管和光电二极管矩阵 显示装置 把从光电监测器中获得的电信号，通过放大器后，以图形或数字等形式显
示出来 主要有四种类型：指针式、LD数字式、VGA屏幕式和计算机式
722 型 可 见 光 分 光 光 度 计
1.数字显示器；2.吸光度调零旋钮；3.选择开关；4.吸光度调斜率电位器； 5.浓度旋钮；6.光源室；7.电源开关；8.波长手轮；9.波长刻度窗；10.式 样架拉手；11.100%T旋钮；12. 0%T旋钮；13.灵敏度调节旋钮；14.干 燥器
吸收池
亦称样品室、比色池或吸收池，由透明材料（有机玻璃、石英或蓝宝石等）


制成 在紫外光波区检测选用石英、蓝宝石比色杯；在可见光波区检测可选用有机 玻璃比色杯 吸收池使用注意事项 吸收池必须与光束方向垂直 每套比色皿的质料、厚度应完全相同，以免产生误差 比色皿上的指纹、油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性，因此在使 用前务必彻底清洗 检测器 是一种光电转换装置，主要是把光强度转变成电讯号，再通过放大器把信号 输送给测量仪器
六、实验思考
如何正确使用722型可见光分光光度计？
考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理是什么？ 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量有什么优缺点？
朗伯-比尔（Lambert-Beer）光吸收定律 设 I0为经过空白校正后入射光的强度，I t为透过光的强度 根据实验得知：It= I0 · －εbc，式中：c 表示吸收物质的摩尔浓度；b表示吸收 10 物质的光径，用cm表示；ε表示吸收物质的摩尔消光系数，它表示物质对光的 吸收特性，不同物质的ε数值不同，所以 It/ I0= 10－εbc 令 T（透射比）= It/ I 0 ， 则T=10－εbc ，lg（1 / T）=εbc lg（l / T）为物质的吸光度（A），则A = 1g（1 / T）＝εbc，此式说明了物质 的吸光度与吸收物质的浓度和光程成正比，这就是Lambert-Beer光吸收定律
722型可见光分光光度计的使用步骤

将灵敏度旋钮调整“1”档（放大倍率最小） 打开分光光度计电源，开盖预热20min 选择所需波长 将空白比色杯垂直放入样品槽，使光面对准光路 将旋钮打至T，开盖调0，闭盖调100 将旋钮打至A，闭盖调0 将样品比色杯放入样品槽，闭盖，读出读数 开盖取出样品比色杯，关闭电源
光源 不同的光源都有其特有的发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的



光源 钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的320～1100nm波长的光谱，光通过三 棱镜折射后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱；该 色谱可作为可见光分光光度计的光源 氢灯的发射光谱：氢灯能发出195～400 nm波长的光谱，可作为紫外光光 度计的光源 单色器 把混合光波分解为单一波长光的装置 在分光光度计中多用棱镜或光栅作为色散元件 棱镜：是根据光的折射原理而进行的分光系统，当一束平行光进入棱镜散 射器后就会按波长顺序分解成单一波长的单色光 光栅：是利用光的衍射和干涉原理进行的分光系统 转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长，调节出入射 狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度 纯粹的单色光只是一种理想情况，实际上只是具有一定波长范围的谱带， 对于单色光纯度来说，狭缝是越窄越好，但光的强度也就越弱
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It Ia
分光光度计的分类 红外分光光度计：测定波长范围为大于760 nm的红外光区 可见光分光光度计：测定波长范围为400～760 nm的可见光区 紫外分光光度计：测定波长范围为200～400 nm的紫外光区的
无论哪一类分光光度计都包括光源、单色器、吸收池、检测器和显示装置。 分光光度计各部件的次序如图所示：
分光光度计的光谱范围：包括波长范围为200～400nm的紫外光区和波长范围 为400～760nm的可见光区 如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，此时在屏上所显示的光谱已不 再是光源的光谱，它出现了几条暗线，即光源发射光谱中某些波长的光因溶液 吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱，不同物质的吸 收光谱是不同的。因此根据吸收光谱，可以鉴别溶液中所含的物质 当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为有一部分光在溶 液的表面反射，一部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶 液，则： 入射光=反射光+吸收光+透过光 如果我们用蒸馏水（或组成此溶液的溶剂）作为“空白”去校正反射等因素 造成的入射光的损失，则： 入射光=吸收光+透过光
三、实验器材
试管及试管架 移液管 722型可见光分光光度计
四、实验材料与试剂
染色液 蛋白标准液（0.1mg/mL） 稀释血清
五、实验操作
制作标准曲线 取6支试管，按下表操作
以各管的相应蛋白浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘出标准曲线
血清蛋白质吸光值的测定：准确吸取0.1mL血清，置于100mL容 量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，再取1支试管，在试管中加入 0.5mL血清稀释液，0.5mL蒸馏水和3mL染色液，混匀后室温放置 15min，在595nm波长处测吸光值 血清蛋白质含量的计算：利用标准曲线，根据血清蛋白测定的 吸光值求出相应的蛋白含量，注意稀释倍数
蛋白质的含量测定（一） ——考马斯亮蓝染色法
一实验目的
了解分光光度技术的一般原理
学习722型可见光分光光度计的操作
熟悉考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理和方法
二、实验原理
分光光度法是一种利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光 谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，所使用 的仪器称为分光光度计 人眼可见的光只占电磁波谱的很小一部分（400~760nm）。它是一种频率较 大的电磁波。电磁波按频率大小，从频率最小的无线电波到频率最大的γ-射线 排成一列，即组成电磁波的波谱，如下图所示