茶叶浸出物提取实验操作步骤与数据处理方法

茶多酚测定
1 原理
茶叶中多酚类物质能与亚铁离子形成紫蓝色络合物。

用分光光度法测定其含量。

2 仪器和用具
实验室常规仪器及下列各项
2.1 分析天平：感量0.0001g。

2.2 分光光度仪。

3 试剂和溶液
所用试剂应为分析纯(AR)，水为蒸馏水。

3.1 酒石酸亚铁溶液：称取0.1g 硫酸亚铁(FeSO
4·7H
2
0)和0.5 g 酒石酸钾钠(CH
14
O
6
KNa。

·4H
2
0 )，用水溶解并定容至100ml容量瓶中。

（以低温保存有效期10天)。

3.2 pH7.5 磷酸盐缓冲液
3.2.1 1/15mol/L磷酸氢二钠：称取23.9g 十二水磷酸氢二钠(Na
2HPO
4
,12H
2
0)，加水溶
解后定容至1000ml容量瓶。

3.2.2 11/15mol/L磷酸二氢钾:称取经110℃烘干2h的磷酸二氢钾(KH
2PO
4
)9.08 g,加水
溶解后定定容至1000ml容量瓶。

取上述 1/15mol/L的磷酸氢二钠溶液850ml和1/15mol/L的磷酸二氢钾溶液150ml混合均匀。

调整PH至7.5即可。

4 操作方法
准确吸取试液1m l，注人25m l的比色管中，加水4m l和酒石酸亚铁溶液5m l，充分混合，再加pH7.5 磷酸盐缓冲液至刻度，用l0mm比色杯，在波长540n m处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)
5 结果计算
茶多酚含量（mg/ml） =A×1.957×2×V
式中：V—测定时的用液量,ml
A—试样的吸光度;
1.957—用10m m比色杯，当吸光度等于0.50时，每毫升茶汤中含茶多酚相当于1.95 7mg。

游离氨基酸测定
1.原理
a-氨基酸在pH8.0条件下与茚三酮共热，形成紫色络合物，用分光光度法在特定的波长下测定其含量。

2.仪器和用具
实验室常规仪器及下列各项：
2.1 分析天平：感量0.0001g 。

2.2 分光光度仪。

3.试剂和溶液
所用试剂应为分析纯(AR)，水为蒸馏水。

3.1 pH8.0 磷酸盐缓冲液：
3.1.1 1/15mol/L磷酸氢二钠：称取2.39g 十二水磷酸氢二钠(Na
2HPO
4
,12H
2
0)，加水溶
解后定容至100ml容量瓶。

3.1. 2 11/15mol/L磷酸二氢钾:称取经110℃烘干2h的磷酸二氢钾(KH
2PO
4
)0.908 g,加
水溶解后定定容至100ml容量瓶。

然后取1/15 mol/L的磷酸氢二钠溶液95 ml和1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液5 ml，混匀。

调整PH 至8.0即可。

3.2 2%茹三酮溶液：称取水合茚三酮(纯度不低于99%)2 g，加50 ml水和80 mg氯化亚锡(SnCl2·2H20)搅拌均匀。

分次加少量水溶解，不断搅动，放在暗处，静置一昼夜，过滤后加水定容至100 ml。

3.3 谷氨酸标准液：称取10mg茶氨酸或谷氨酸(纯度不低于99 )溶于100 ml水中，作为工作液(1 ml含茶氨酸或谷氨酸0.1 mg)。

4操作方法
4.1 测定
准确吸取试液1m l，注人25mL的比色管中，加1mlpH8.0 磷酸盐缓冲液(6.1)和
1 ml2%茚三酮溶液(6.2)，在沸水浴中加热30min。

待冷却后加水定容至25 ml。

放置10 min后，用5 mm比色杯，在570 nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A),
4.2氨基酸标准曲线的制作
分别吸取0、1.0、1 .5、2.0、2.5、3.0ml氨基酸工作液于一组25ml比色管中，各加水4 ml、
pH 8.0磷酸盐缓冲液1 ml和2%茚三酮溶液1 ml,，在沸水浴中加热30 min，冷却后加水定容至25 ml，按7. 3. 2的操作测定吸光度(A)。

将测得的吸光度与对应的茶氨酸或谷氨酸量绘制标准曲线
8 结果计算
游离氨基酸量（mg/ml）=样液测得吸光度在标准曲线上对应的氨基酸量
咖啡碱测定
1.原理
茶叶中的咖啡碱易溶于水，除去干扰物质后，用特定波长测定其含量。

2.仪器和用具
实验室常规仪器及下列各项：
紫外分光光度仪。

分析天平：感量0.0001g。

3.试剂和溶液
所用试剂应为分析纯(AR)，水为蒸馏水。

3.1 碱式乙酸铅溶液：称取50g碱式乙酸铅，加水100 ml，静置过夜，倾出上清液过滤。

留滤液。

3.2 盐酸：0.01mol/L溶液，取0.9 ml浓盐酸，用水稀释至1L ，摇匀
3.3 硫酸：
4.5 mol/L溶液，取浓硫酸250ml，用水稀释至1L，摇匀
3.4咖啡碱标准液：称取100 mg咖啡碱(纯度不低于99%)溶于100 ml水中，作为母液，准
确吸取5 ml，加水至100 ml作为工作液（1ml含咖啡碱0.05 mg)。

4.测定步骤
4.1 用移液管准确吸取试液10ml，移人100ml容f瓶中，加人4ml 0.01 mol/L盐酸)和1 ml碱
式乙酸铅溶液，用水稀释至刻度，提匀，静置澄清过滤，准确吸取滤液25 ml，注人50m l容量瓶中，加人0.1ml 4.5mol/L硫酸溶液，加水稀释至刻度，混匀，静置澄清过滤，留滤液。

用10 mm比色杯，在波长274 nm处以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)。

4.2 咖啡碱标准曲线的制作
分别吸取0、1、2、3、4、5、6ml咖啡碱工作液于一组25ml比色管中，各加人1.0 m l盐酸，用水稀释至刻度，混匀，用10 mm石英比色杯，在波长274 nm处，以试剂空自溶液作参比，测定吸光度(A) ，将测得的吸光度与对应的咖啡碱量绘制标准曲线。

5.结果计算
咖啡碱（mg/ml）=样液测得的吸光度在标准曲线上对应的咖啡碱的量
（数据处理方法与氨基酸测定相同）
水浸出物测定
4 原理
干燥前后的质量差
5 仪器和用具
实验室常规仪器及下列各项：
鼓风电热恒温干燥箱：温控120℃士2℃
沸水浴
于燥器：内盛有效于燥剂
称量皿
分析天平：感量0.0001g 。

6 操作方法
用分析天平称量干燥的称量皿质量，记录为m。

然后准确量取25ml试样于称量皿中，移人沸水浴中蒸干。

再取出至于120℃±2℃的恒温干燥箱内烘1h，加盖取出冷却1h再烘1h，立即移人干燥器(5.5)内冷却至室温，称量其质量，并记录为M。

7 结果计算
水浸出物（mg/ml）=1000（M－m）/25
式中：M一浸出物和称量瓶质量，g；
m—干净，干燥的称量瓶质量，g。

蛋白质含量测定
1原理
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液时呈棕红色，与蛋白质结合后变为蓝色。

2实验仪器
分光光度计
3试剂
3.1考马斯亮蓝G-250染色液：去考马斯亮蓝100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1000ml。

3.2标准蛋白液：在分析天平上精确确称取0.1g结晶牛血清蛋白，于小烧杯中加入少量蒸馏水溶解，然后转入100ml容量瓶中，定容至刻度，制成牛血清蛋白浓度为1mg/ml的标准液。

4操作方法
4.1 测定
准确吸取茶试液0.5m l，注人10mL的比色管中，再加入5.0ml考马斯亮蓝G-250染色液，再加入0.5ml水。

放置5 min后，用5 mm比色杯，在595 nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A),
4.2 蛋白质标准曲线的制作
分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml蛋白质标准液于一组10ml比色管中，再加入5.0ml 考马斯亮蓝G-250染色液，在分别加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml水。

放置5 min后，用5 mm 比色杯，在595 nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A),将测得的吸光度与对应的蛋白质的量绘制标准曲线
5 结果计算
蛋白质的量（mg/ml）=样液测得吸光度在标准曲线上对应的蛋白质的量
（数据处理方法与氨基酸测定相同）。