阿霉素脂质体的制备及抗肿瘤活性研究_李飞阳1崔纯莹1王玉记2吴建辉2

2015年4月 第36卷　第2期
首都医科大学学报Journal of Capital Medical University
Apr.2015Vol.36　No.2
基金项目: 十二五”重大新药创制科技重大专项(2011ZX09302⁃007⁃01)㊂This study was supported by Significant New Drugs Creation Five⁃year”
Plan Special Science and Technology Major(2011ZX09302⁃007⁃01).
*Corresponding author,E⁃mail:wujianhui01@
网络出版时间:2015-04-00　09∶39　网络出版地址:http:∥ /kcms /detail /11.3662.R.20131205.0939.001.html [doi :10.3969/j.issn.1006⁃7795.2015.02.001]
㊃纳米制剂研究㊃
阿霉素脂质体的制备及抗肿瘤活性研究
李飞阳1　崔纯莹1　王玉记2　吴建辉2*
(1.首都医科大学化学生物学与药学院药剂学系,北京100069;2.首都医科大学化学生物学与药学院药物化学系,
北京100069)
【摘要】　目的　开发一种新型阿霉素脂质体制剂㊂方法　采用膜分散法制备阿霉素脂质体;采用MTT 法考察阿霉素和阿霉素脂质体对5种人类肿瘤细胞株增生的抑制作用;以荷S180小鼠为模型,考察阿霉素和阿霉素脂质体的抗肿瘤活性㊂结果　膜分散法适用于制备阿霉素脂质体,其平均包封率高于95%;阿霉素制备成脂质体仍具备抑制肿瘤细胞株增生活性,并呈现时间依赖关系;动物实验表明,阿霉素脂质体的抗肿瘤活性比阿霉素强,毒性比阿霉素低㊂结论　此法制备的脂质体包封率高,简便易行,重现性好,并且显示了较好的抗肿瘤活性㊂
【关键词】　阿霉素脂质体;肿瘤细胞增生;释放曲线;抗肿瘤活性【中图分类号】　R 965.1
Preparation and antitumor activity of a novel liposome of doxorubicin
Li Feiyang 1,Cui Chunying 1,Wang Yuji 2,Wu Jianhui 2*
(1.Department of Pharmacy ,School of Chemical Biology and Pharmaceutical Sciences ,Capital Medical University ,Beijing 100069,
China ;2.Department of Medicinal Chemistry ,School of Chemical Biology and Pharmaceutical Sciences ,Capital Medical University ,Beijing 100069,China )
【Abstract 】　Objective　To develop a novel preparation of liposomal doxorubicin.Methods　The liposome was prepared by dispersion film assay,loaded doxorubicin by ammonium sulfate gradient method,the anti⁃proliferation activities of doxorubicin liposome and doxorubicin against cancer cells evaluated by MTT assay and the antitumor activities of doxorubicin liposome and doxorubicin on S180mouse model were measured.Results　The doxorubicin liposome encapsulation efficiency was more than 96.3%at different time points.Doxorubicin liposome effectively inhibited the proliferation of carcinoma cells.The in vivo anti⁃tumor activity and toxicity of doxorubicin liposome were significantly higher and lower than that of doxorubicin,respectively.Conclusion　The method is practicable to prepare doxorubicin liposome having good antitumor potency in vivo.
【Key words 】　doxorubicin liposome;cytotoxicity;releasing curve;anti⁃tumor activity in vivo
阿霉素是由放线菌的发酵液中提取的重要的氨基糖苷类抗肿瘤药物,广泛用于治疗血液系统癌症㊁
实体瘤和肉瘤[1]㊂阿霉素是明确的DNA 嵌插剂,通过芳香平面结构嵌入到DNA 双螺旋结构的碱基对之间,抑制DNA 拓扑异构酶II,终止DNA 转录[2]㊂此外,阿霉素还可导致DNA 损伤和表观遗传反常[3]㊂
由于心脏毒性大,阿霉素的临床剂量与疗效也大受限制㊂脂质体作为药物输送系统,具有改善药物的药代动力学㊁体内分布和降低毒性的优点㊂文献[4]报道蒽环霉素脂质体包封率高,治疗原发性和转移性乳腺癌的活性好㊁心脏毒性低㊂本文将抗肿瘤药物阿霉素
(doxorubicin,DOX)包封于脂质体中㊂考察在各介质中DOX 的释放能力,并评价抗肿瘤活性,为进一步研究脂质体剂型积累实验基础㊂
1　材料和方法
1.1　材料与仪器
DOX (浙江海正药业股份有限公司);DMEM 培
养基(HyClone 公司,美国);胎牛血清(Gibco 公司,美国);卵磷脂㊁胆固醇㊁DPPC㊁DOPE㊁DSPE⁃PEG2000㊁四甲基偶氮唑盐(MTT)㊁二甲基亚砜(DMSO)(Sigma 公司,美国);其他试剂均为分析纯㊂肿瘤细胞MCF⁃
2015-04-10 08:42/kcms/detail/11.3662.r.20150410.0842.009.html
首都医科大学学报第36卷
7㊁A375㊁HepG2㊁SYHY5Y㊁Hela(由中国医学科学肿瘤细胞库购进,自行传代,中国);Transwell培养板(聚碳酸酯膜,96孔,Costar公司,美国);Sepharose G50(Sig⁃ma公司,美国);透析袋(MW12000⁃14000)(Sigma 公司,美国);孔径分别为0.8μm㊁0.45μm㊁0.2μm 的聚碳酯膜(Whatman公司,美国);Microplate Read⁃er㊁酶标仪㊁UV⁃2200PC荧光分光光度计(尤尼可公司,日本);聚碳酯膜过滤器(Millipore公司,美国)㊂1.2　方法
1.2.1　DOX脂质体的制备
采用经典的薄膜分散法制备空白DOX脂质体㊂分别称取处方量的20mmol卵磷脂㊁29mmol胆固醇㊁10mmol DPPC㊁40mmol DOPE和1mmol PEG,置于茄瓶中加入适量氯仿溶解㊂超声30s使其充分混合均匀㊂用旋转蒸发仪减压浓缩除去氯仿,经40℃真空干燥过夜㊂加入适量250mmol/L硫酸铵溶液将脂膜水化㊂充氮气,在50℃水浴中温育㊁超声㊂采用硫酸铵梯度法载入DOX,取脂质体悬浮液10mL置于透析袋中,在磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4,2L)中进行透析㊂脂质体囊泡经过聚碳酯膜(膜孔直径分别为0.8μm㊁0.45μm㊁0.2μm)依次挤压后形成带有硫酸铵梯度的空白单室脂质体㊂在调节至10mg/mL的空白脂质体中逐滴加入含1mg/mL DOX的水溶液,使药脂比为10∶1,混匀,水浴40℃孵育20min,即得DOX脂质体㊂1.2.2　DOX脂质体表征与包封率
取制备的DOX脂质体用激光粒度测定仪测定其粒径分布和Zeta电位㊂测定温度为25℃,平衡时间为9min,介质折光率为1.3471,黏度为1.148mPas㊂取0.2mL脂质体加于Sephadex G50凝胶柱顶部,用水洗脱,流速0.67mL/min,收集脂质体部分洗脱液,每管洗脱液用10%曲拉通定容至5mL,采用荧光分光光度法测量DOX浓度㊂根据DOX脂质体的洗脱曲线,计算包封率㊂
包封率(%)=(上柱后脂质体中DOX量/上柱前脂质体中DOX量)×100%㊂
1.2.3　DOX脂质体体外释放及血浆稳定性
1)DOX荧光标准曲线:精密称取DOX标准品10 mg,置于100mL量瓶中,加PBS溶解并定容至刻度,即得浓度为100μg/mL的DOX标准储备液㊂精密吸取0.1㊁0.2㊁0.5㊁1.0㊁2.0㊁4.0㊁6.0mL DOX标准储备液加至10mL容量瓶中,PBS定容至10mL,混匀即得浓度为1.0㊁2.0㊁5.0㊁10.0㊁20.0㊁40.0和60.0μg/mL的DOX标准液㊂以Ex/Em(470nm/594nm)为激发/发射波长,测定荧光光谱,并绘制荧光标准曲线㊂2)DOX脂质体体外释放和血浆稳定性:取2mL⁃DOX脂质体放入透析袋内两头夹紧,置于35mL pH 为7.4或6.8的PBS缓冲液中透析㊂并于37℃的恒温振荡器中振荡(140r/min),于1㊁2㊁4㊁6㊁12㊁24㊁48㊁72h取5mL透析液测定荧光强度,计算DOX脂质体的累积释放量㊂
取小鼠血浆适量,离心取上清,标记相应时间点,在1mL的血清中加入100μg/mL脂质体0.1mL和同等量的DOX溶液,放置于37℃中㊂在相应时间点终止反应,测定其荧光强度㊂
1.2.4　DOX脂质体抗肿瘤细胞增生活性测定(MTT
法)[5]
将对数生长期的人肝癌细胞HepG2㊁人宫颈癌细胞HeLa㊁黑色素瘤细胞A375㊁人乳腺癌细胞MCF⁃7和人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y细胞按每孔3000~ 4000个接种于96孔板中,4~6h后分别加入不同终浓度的DOX和DOX脂质体,每组设6复孔,在37℃, 5%CO2条件下培养24㊁48㊁72h后,每孔加入25μL MTT(5mg/mL)继续培养,4h后吸掉上清液,每孔加入150μL DMSO,在490nm波长下检测每孔吸光度(A)值㊂计算细胞增生抑制率㊂
细胞抑制率%=(1-实验组A值/对照组A值)×100%㊂采用回归方程式分别求出5株细胞对DOX 游离药和DOX脂质体的IC50值,以上过程重复3次㊂1.2.5　测定DOX与DOX脂质体抗肿瘤活性[6] 1)荷S180肿瘤小鼠模型:取腹腔接种S180腹水瘤第8天的ICR小鼠,乙醚麻醉后脱颈椎处死,用75%乙醇消毒后置于超净台内,用镊子夹起腹部中线偏右的皮肤并剪一小口至可见乳白色腹水流出㊂将吸管由开口处轻轻插入腹腔吸出腹水,1000r/min离心5min㊂弃去上清液后,残留物加9mL灭菌0.9%氯化钠注射液,吹打均匀后,1000r/min离心5min,弃去上清液㊂向试管底部的乳白色胶状物中加9mL灭菌0.9%氯化钠注射液,用吸管轻轻吹气,使瘤细胞均匀分散㊂经台盼兰染液于显微镜下计算活细胞的个数㊂将原液中的存活瘤细胞稀释成1.5×107个/mL,用于接种㊂用2%碘酒棉球和75%乙醇棉球在小鼠右侧腋下消毒,并注入0.2mL瘤细胞液,缓缓抽出针头㊂按此方法给每只ICR种小鼠接种后分组(每组15只),放入动物室饲养㊂
2)给药方法:于接种第2天开始按照如下给药方
2
第2期李飞阳等:阿霉素脂质体的制备及抗肿瘤活性研究
案,腹腔注射给药㊂①0.9%氯化钠注射液组;②DOX(2μmol /kg,24h /次,共给药8次);③DOX(2μmol /kg,48h /次,共给药4次);④DOX(6μmol /kg,
48h /次,共给药4次);⑤DOX 脂质体(2μmol /kg,24h /次,共给药8次);⑥
DOX 脂质体(6μmol /kg,48h /次,共给药4次)㊂
3)抑瘤率㊁心指数计算:于肿瘤接种第10天,将各组小鼠经乙醚麻醉后脱颈处死,钝性剥离肿瘤并剖取心脏,称质量,并计算抑瘤率及心指数㊂抑瘤率(%)=〔(阴性对照组平均瘤质量-治疗组平均瘤质量)/阴性对照组平均瘤质量〕×100%㊂
1.3　统计学方法
以Origin 8.0软件建立并录入数据,采用SPSS
17.0对数据进行分析,计量数据以均数±标准差(⎺x ±s )表示,组间显著性检验采用正交设计的方差分析,
以P <0.05为差异有统计学意义㊂
2　结果
2.1　DOX 脂质体粒径和包封率
经激光纳米粒度仪测定结果显示,用硫酸铵梯度法制备的DOX 脂质体平均粒径为(183.0±22.3)nm (n =5),Zeta 电位为-20.5~-31.8mV(n =5)㊂该结
果表明,DOX 脂质体粒度分布均匀,Zeta 电位-20~-40mV,说明粒子呈负电性且稳定存在㊂
用荧光分光光度计测定DOX 荧光强度(Ex 为
470nm,Em 为594nm),以荧光强度对浓度作图㊂求得阿霉素的荧光标准曲线方程为F =237.11C +7.8463,r =0.9994,表明在0.1~60μg /mL 浓度范围内,DOX 的荧光强度和浓度间的线性关系良好㊂平均回收率为98.9%(n =3)㊂
计算DOX 脂质体的包封率为95%(n =3)㊂2.2　DOX 脂质体释放和血浆稳定性
由释放曲线(图1A)可知,DOX 释放速度快,6~
12h 释放量达到80%以上㊂DOX 脂质体在pH 为7.
4或6.8的PBS 缓冲液中24h 才基本完全释放,显示缓慢释放的特征㊂DOX 脂质体在血浆中,12h 累积释放率不到65%,可以较稳定地存在(图1B)㊂
图1　DOX 脂质体的在pH 为7.4及6.8环境下的体外释放曲线(A )和血浆稳定性曲线(B )
Fig.1　The release profile of doxorubicin liposome (A )and serum stability of DOX⁃lipsome (B )
DOX :doxorubicin.
2.3　DOX 脂质体抗肿瘤细胞增生活性
在抗肿瘤细胞增生实验中,DOX 和DOX 脂质体
对A375㊁HepG 2㊁HeLa㊁MCF⁃7㊁SHY5Y 增生的抑制作用显示,它们对5种细胞增生都有一定的抑制作用,细胞系间敏感性差异很大㊂其中以SHY5Y 细胞系对DOX 最不敏感,A375细胞系最敏感㊂在相同浓度下,
DOX 的活性明显大于DOX 脂质体,说明将DOX 制备成脂质体可以逐步释放DOX㊂因为包载于脂质体中DOX 必须被释放到体系中才能杀伤肿瘤细胞㊂DOX
和DOX 脂质体对5株肿瘤细胞的抑制作用呈现时间依赖关系,详见表1㊂
2.4　DOX 脂质体抗肿瘤活性
由表2可见,DOX 脂质体有优越的抗肿瘤活性.虽然DOX 在剂量为2μmol /kg 每天给药,抑瘤率也能达到75%,但毒性较大,小鼠存活率仅为53%㊂而DOX 脂质体的抑瘤率为77%,小鼠存活率为87%㊂也就是说,DOX 脂质体将小鼠的生存率提高到了DOX 的162%㊂在6μmol /kg 剂量下DOX 脂质体将
3
首都医科大学学报第36卷
表1　DOX和DOX脂质体对肿瘤细胞增生的抑制作用
Tab.1　Anti-proliferation activities of DOX and DOX liposome against cancer cells
Groups (culture time)
IC50/(μmol㊃L-1)
A375HepG2Hela MCF⁃7SHY5Y
DOX/24h 1.25±0.15 1.98±0.042 4.41±0.28 1.71±0.0225.09±2.54
DOX⁃lipsome/24h 1.79±0.06 4.44±0.1215.37±1.52 6.60±0.4133.01±4.50
DOX/48h0.16±0.010.32±0.0550.15±0.00570.18±0.001 1.26±0.13
DOX⁃lipsome/48h0.21±0.004 2.90±0.004 2.96±0.21 2.24±0.17 3.99±0.05
DOX/72h0.005±0.0010.05±0.00030.05±0.00240.015±0.0010.52±0.01
DOX⁃lipsome/72h0.02±00140.24±0.004 1.30±0.0250.45±0.05 1.64±0.14 DOX:doxorubicin.
小鼠的生存率提高到了DOX的500%㊂可见,DOX
脂质体缓慢释放DOX不会降低DOX的疗效,却会降
低DOX的毒性㊂
从心指数指标上看,2μmol/kg DOX组经24h给
药后,心指数与0.9%氯化钠注射液组差异有统计学
意义(P<0.01),而DOX脂质体(2μmol/kg,24h)与
0.9%氯化钠注射液组比较差异无统计学意义,说明
DOX有明显的心脏毒性,将DOX制备成脂质体后心
脏体质量比无明显变化,表明有效地降低了心脏毒
性,详见表3㊂
表2　DOX和DOX脂质体的抗肿瘤活性
Tab.2　The anti⁃tumor activities of DOX and DOX liposome
Group Dose Dosing
intervals Tumor weight/g (⎺x±SD)
Survival
rate/%
NS0.2mL/mouse24h 2.328±0.312100 DOX2μmol/kg24h0.582±0.172**53.3 DOX2μmol/kg48h0.870±0.270**100 DOX6μmol/kg48h0.233±0.151**13.3 DOX liposome2μmol/kg24h0.535±0.274**△86.6 DOX liposome6μmol/kg48h0.349±0.146**▲▲66.6　NS:normal saline;n=15,**P<0.01vs NS△P<0.05▲▲P<0.01vs2μmol/kg48h interval DOX;DOX:doxorubicin.
表3　DOX和DOX脂质体对心脏指数的影响
Tab.3　The heart indexes effect of DOX and
DOX liposome(n=15) Group Dose Dosing intervals Heart index NS0.2mL/mice24h 5.12±0.05 DOX2μmol/kg24h 6.78±2.61** DOX2μmol/kg48h 5.40±1.22 DOX6μmol/kg48h 6.03±1.20 DOX liposome2μmol/kg24h 5.27±1.14 DOX liposome6μmol/kg48h 6.15±0.98** NS:normal saline;*P<0.05,**P<0.01vs NS group;
DOX:doxorubicin.
3　讨论
本研究采用硫酸铵梯度法制备得到了DOX脂质体㊂该脂质体在电镜下观察为圆形小球,用粒径测定仪测定的粒径约为200nm,Zeta电位约为-20~-40mV㊂硫酸铵梯度法制备的DOX脂质体的包封率为95%以上,1个月内的泄漏率小于5%㊂体外释放度实验表明DOX脂质体有一定的缓释作用㊂虽然DOX从透析袋释放速度快,4h就已经释放了90%,而DOX脂质体释放速度较慢,12h才释放85%㊂血浆稳定性实验表明,DOX脂质体可以稳定存在于小鼠血浆,12h释放度不足30%㊂在S180小鼠模型上, DOX脂质体的抗肿瘤活性略高于DOX本身,毒性则明显低于DOX㊂
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(收稿日期:20141228)编辑　陈瑞芳
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