观赏向日葵不同花色物质组成的靶标代谢组学分析

南京农业大学学报2021，44(3):437-446
Journal of Nanjing Agricultural University D01:10.7685/jnau.202008019 I
赵君，徐剑文,刘剑光，等.观赏向日葵不同花色物质组成的靶标代谢组学分析[」].南京农业大学学报,2021,44(3) :437-446.
ZUA0 Jun，XL Jianwen，LlL Jia^igua^ig，et al. Target m etabolomic analysis of material com position using a pair of near isogenic lines w ith different floral colors in sunf!ower[ J]. Journal of Nanjing Agricultural Lniversitv，2021，44(3) ：437-446.
观赏向日葵不同花色物质组成的靶标代谢组学分析
赵君1，徐剑文1，刘剑光1，陈涛2,施洋2,戚永奎2*，肖松华卜
(1.江苏省农业科学院经济作物研究所/农业农村部长江下游棉花和油菜重点实验室，江苏南京210014;
2.江苏沿海地区农业科学研究所，江苏盐城224002)
摘要：[目的]本文旨在解析不同花色观赏向日葵的代谢物差异。

[方法]通过靶向代谢组学的方法，对‘盐葵4号’和‘盐葵5号’不同颜色的花和茎中相关代谢产物含量进行测定，筛选差异代谢物，并对差异代谢物参与的代谢通路进行鉴定与分析，解析组织呈现不同颜色的代谢物质基础。

[结果]通过广泛靶向代谢组学，共检测到647种代谢物，其中紫色花组织显著高于白色花组织的代谢物有140种，紫色花组织显著低于白色花组织的代谢物有224种;紫色茎组织显著高于白色茎组织的代谢物有48种，紫色茎组织显著低于白色茎组织的代谢物有104种。

‘盐葵4号’紫色花中特异上调物质有123种，紫茎中特异上调物质有31种，紫花和紫茎共同上调的物质有17种。

对差异代谢物进行KEG G代谢通路富集分析，结果显示差异代谢物参与多条代谢途径，其中花青素代谢途径在不同颜色的组织都显著富集。

在紫色组织中参与花青素代谢途径的显著上调代谢物为矢车菊素、矢车菊素-3-0-葡萄糖苷和飞燕草素-3-〇-3\6"-〇-二甲酰葡萄糖苷;在白色组织中显著上调的与颜色相关的代谢物为槲皮素、黄芪碱、异槲皮素、杨梅素和芦丁。

另外，3种山奈酚类衍生物质在紫色组织中显著上调，可能在紫色组织形成过程中扮演重要角色。

[结论]矢车菊素可能是‘盐葵4号’紫色组织呈色的主要物质，而槲皮素、黄芪碱、异槲皮素、杨梅素和芦丁等与其他颜色相关的代谢物是‘盐葵5号’呈色的主要物质。

部分黄酮类物质合成下调，而花青素类物质合成上调可能是‘盐葵4号’花和茎组织呈现紫色的主要原因。

关键词:观赏向日葵;广泛靶向代谢组学;花色;代谢物;矢车菊素
中图分类号:S565.5 文献标志码：A 文章编号：1000-2030(2021)03-0437-10
Target metabolomic analysis of material composition using
a pair of near isogenic lines with different
floral colors in sunflower
ZHAO Jun1，XU Jianwen1，LlU Jianguang1，CHEN Tao2，SHl Yang2，Ql Yongkui2*，X1A0 Songhua1*
(1.Institute of Industrial Crops/Key Laboratory of Cotton and Rapeseed，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China；
2.Agricultural Science Institute of Coastal Region of Jiangsu，Yancheng 224002，China)
A bstract ：[ Objectives ] The aim of this study w，as to analyze the metabolite differences of different flower colors of ornamental sunflow-er. [ Methods] In this study，the contents of metabolites of floral and stem of sunflow-er varieties ‘ Yankui 4 ’ and ‘ Yankui 5 ’ with different color were determinated using the widely targeted metabonomics. The different metabolites and the metabolic pathways were screened and analyzed，and the metabolic material basis about the tissue present different colors w-as acquired preliminarily. [ Results ] In this study，647 metabolites w-ere detected by wddely targeted metabolomics using different color flow-er and stem of ‘ Yankui 4 ’ and ‘Yankui 5’. Among them，140 metabolites in purple flowers w-ere significantly higher than those in white flow-ers，and 224 metabolites in purple flow-ers were significantly low-er than those in white flowers. 48 kinds of metabolites were significantly higher and 104 kinds of metabolites were significantly lower in purple stem compared to white stem. There were 123 specific up-regulated substances in the purple flow-er of ‘ Yankui 4 ’，but only 31 specific up-regulated substances in the purple stem，17 simultaneously up-regulated substances in the purple flow-er and the purple stem compared to the white flow-er and stem of ‘ Yankui 5 ’. The result of KEGG path­ways enrichment analysis show-ed that the differential substances participated in multiple metabolic pathw-ays，among which anthocyanin metabolism pathway was significantly enriched in different color tissues. The mainly significantly up-regulated metabolites were anthocy-收稿日期：2020-08-17
基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[CX( 18)3077]
作者简介:赵君，博士，副研究员，研究方向为种质创新与分子育种，E-mail:sxzhaojuii88@ 。

*通信作者：肖松华，研究员，主要从事作物遗传育种研究，E-mail:**************;戚永奎，副研究员，主要从事作物遗传育种研究，E-mail:*****************。

438南京农业大学学报第44卷
anin,cyanidin-3-0-glucoside and delphinidin-3-0-3,,6^-0-dicarboxylic glucoside which participated in anthocyanin metabolic pathway in purple tissues. Quercetin, astragalosine, isoquercetin, myricetin and rutin were significantly up-regulated in white tissues. Three kaempferol derivatives were significantly up-regulated in purple tissue,w-hich might play important roles in the color for^mation of purple tissue. [ Conclusions ] Cyanidin was the main substance which presented the purple colour for the tissue of ‘ Yankui 4 5, while quercetin,astragalosine, isoquercetin, myricetin and rutin were the main substances related to the different color of the tissues of ‘Yankui 5’. The down-regulation of some flavonoids synthesis and the up-regulation of anthocyanins synthesis might be the main reason for the color formation of purple flower and stem of ‘Yankui 4’.
Keywords ：ornamental sunflower；widely targeted metabonomics；floral color；metabolites；cyanidin
向日葵(制—s 〇肌_)根据用途可划分为磕食型、油用型和观赏型[|-2]。

观赏型葵花因其花色鲜 艳多样,广泛用于切花、盆花、染色花、庭院美化及花境营造等领域[3]。

植物花色的形成是多种因子协同 作用的结果，涉及多种代谢物质,其中最主要的是色素。

色素有许多种类,主要包括类胡萝卜素、类黄酮和 生物碱等三大类[4-6]。

不同颜色的植物组织中包含的色素种类或含量不同[5]，其中紫色花形成的主要色 素是花青苷[6]。

花青苷的生物合成是由多个酶催化完成的，编码这些酶的几乎所有基因均已分离，这些 基因可以分成结构基因和调节基因，如苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合酶、MYC(myelocytomatosis)和MYB (myeloblastosis)类转录因子基因等[7]。

钟培星[8]研究表明，芍药花瓣中类黄酮的组成和含量在品种间差 异明显,尤其在不同色系之间,但差异主要是由花青苷含量导致的。

白色和黄色品种不含花青苷或含有微 量的花青苷;红紫色的品种一般含有5~8种花青苷;查尔酮是组织呈现黄色的重要色素。

张剑亮等[9]利 用质谱分析方法分析观赏向日葵花瓣色素的主要组分，结果表明花色素苷类化合物天竺葵色素、锦葵色素 和矢车菊素及其他苷类物质可能是花瓣呈现紫红色和红褐色的主要原因，红花苷可能是决定观赏向口葵 花瓣呈现黄色或浅黄色的关键物质。

利用现代生物技术手段,定量分析不同颜色向日葵花器官中的代谢 物质差异，可以为今后培育不同种类观赏向日葵提供一定指导，为解析向日葵花色形成的分子机制提供 基础。

代谢组学主要分为非靶标代谢组学和靶标代谢组学[1°-11]。

目前非靶标代谢组学的应用比较普遍，可 以全面分析生物体内代谢物种类，但是其存在准确度不够、特异性缺乏等缺点。

靶标代谢组学利用前期建 立的各种代谢物数据库，结合多种代谢通路,对目标代谢物进行定量分析，准确度高，特异性强，弥补非靶 标代谢组学的不足[12-14]。

在本研究中，以2种不同花色的葵花为材料，利用靶标代谢组学定量分析不同 花色葵花中代谢物差异,并对差异代谢通路进行富集，为不同花色葵花品种选育及葵花花色形成的分子机 制解析提供一■定的理论指导。

1材料与方法
1.1植物材料
‘盐葵4号’和‘盐葵5号’是江苏沿海地区农业科学研究所自主选育的观赏葵花品种，‘盐葵5号’是 ‘盐葵4号’种植过程中选育的自然突变株系。

‘盐葵4号’舌状花为纯橙黄色,管状花、雌蕊以及萼片顶 端为紫色,下胚轴为紫色。

‘盐葵5号’舌状花为乳白色,管状花、雌蕊以及萼片顶端为淡黄色（图1)。

以‘盐葵4号’和‘盐葵5号’子叶展平后地上部长度为2 cm的下胚轴（在文中紫色下胚轴被称为紫茎，简写 为ZJ;白色下胚轴被称为白茎,简写为BJ)以及管状花、雌蕊和萼片的顶端颜色存在显著差异的部位（在 文中紫色花组织被称为紫花,简写为ZH;白色花组织被称为白花,简写为BH)为材料。

每个样品分别取 10株混合，放人液氮速冻后-80丈保存，用于代谢组分析。

每个材料3次重复。

1.2仪器及试剂
主要试剂包括甲醇(67-56-l,LC-MS级,Honeywell)、甲酸（64-18-6,98%,SIGMA)、乙腈（75-05-8, LC-MS级,Honeywell);主要仪器包括超高效液相色谱仪（1290 UHPLC,Agilent;XCIEX AD,AB Sciex)、高 分辨质谱仪（Q-Tof,AB Sciex)、高灵敏度质谱仪（Q-Trap 6500,AB Sciex)、纯水仪（明澈D24 UV,Merck Millipore)。

其中超高效液相色谱仪使用的色谱柱为Waters公司生产的T3色谱柱（ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 pmX2.1 mmXl00 mm)。

1.3代谢物提取方法
首先将样品冷冻干燥，利用JXFSTPRP-24研磨仪进行研磨（60 Hz,2 min);取100 mg样品加人到
第3期赵君，等:观赏向日葵不同花色物质组成的靶标代谢组学分析439
2m L 离心管中，加入1.5m L 提取液（甲醇、水体积比为3:1)，涡旋30 s
后冰水浴超声15
m in ，混匀仪上
4
过夜后，4T ；、12〇〇〇r .min 1离心15爪匕;小心吸取上清液置于2
爪[
进样瓶。

每个样品取等体积混合
成
Q C (q u ality co n tro l)样品，用于上机检测14_。

B
E H
I
r >f Q P
0.8 cm
YK 5
0.8 cm
YK 5
YK 4
YK 4
C
F
G
图1
‘盐葵4号’（Y K 4)和‘盐葵5号’（Y K 5)表型
Fig. 1 Phenotypes of ‘ Yankui 4’（ Y K 4) and ‘ Yankui 5’（ Y K 5)
A .植株 Plant;
B ，
C .花盘 F lom ，er disc;
D .花辨 Petal;
E ，
F .苞片 Bud piece;H ，I .柱头和管状花 Stigma and tubular rkm ，er;
G .出 苗后 10 d 幼苗 Seedlings 10 days alter emergence.
1.4上机检测及相关参数设置
使用W a te r s 的U PLC H SS T 3色谱柱（1.8
p m X 2.1m m X 100 m m )，柱温箱温度设为40丈，自动进样器
温度设为4
丈，进样体积为2 ^L 。

流动相A
为体积分数为0.1%的甲酸水溶液，流动相B 为体积分数
.1%
的甲酸乙腈溶液。

色谱梯度见表
1。

表1
液相色谱洗脱时流动相条件
Table 1 The conditions of mobile phase in H PLC elution
时间/min
Time
流速/( pL.min_i )Velocity of flow
流动相A 比例/%■
Proportion of mobile phase A
流动相B 比例/%■
P r oportion of mobile phase B
0.00
4009820.50
400982
10.00400505011.00
40059513.00400595
13.0140098215.00
400
98
2
使用Q -Tof 高分辨质谱仪获得二级谱数据，构建多反应监测（MRM )库（母离子与二级谱中子离子组 合成的离子对），再使用Q -Trap 高灵敏质谱仪以MRM 模式进行质谱分析得到检测的原始数据。

将采集获 得的数据用本实验室自建的数据库及MAPS
软件进行数据分析。

440南京农业大学学报第44卷
Q-Tof 5600+质谱仪参数设置如下：使用Q-T o f高分辨质谱，通过IDA (information-dependent acquisition)模式进行高分辨质谱数据采集。

数据采集软件（Analyst)依据一级质谱数据和预先设定的标 准，自动选择离子并采集其二级质谱数据。

每个循环选取12个强度大于100的离子。

离子源参数如下：离子喷射电压+5 500/-4 500 V,帘气压力35 psi,离子源温度600 T!,离子源气压60 psi,去簾电压±100 V。

数据采集时按如下 mass range进行分段：100 〜300、300 〜450、450 〜600、600 〜750、750 〜1 200。

Q-Trap 6500 质谱仪器参数设置与Q-Tof5600+质谱仪参数设置相同。

1.5代谢物鉴定
首先用高分辨质谱仪对样品进行超高覆盖率的二级质谱扫描，以获取所有代谢物的二级谱图（MS2), 然后从中提取MRM离子对信息，对样本进行特异性建库，再利用三重四极杆质谱MRM技术进行精确 定量[I5]。

1.6数据分析
本研究分析时用到的数据是由原始数据矩阵处理而来。

计算及数据处理方法如下:对原始数据中的 缺失值进行模拟（missing value recoding)，数值模拟方法为最小值二分之一法，并利用每个样本的总离子 流（total ion current，TIC)进行归一-化处理。

用ProteoWizard软件将高分辨质谱原始数据转成mzXML格式,再使用MAPS软件（XCMS内核）进行 保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作。

使用自撰写R程序包和自建二级质谱数据库对 峰进行物质鉴定。

使用Skyline软件对MRM数据进行处理[|6]。

将数据矩阵导人SIMCA软件包，并进行 无监督的主成分分析（principal component analysis，PCA)和有监督的（正父）偏最小二乘法（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)分析。

依据 0PLS-DA模型第一主成分变量的重要性投 影（variable importance in the projection，VIP)值>1.0 且 t测验的 _P<0.05 来筛选组间的差异代谢物[17-18]。

利用KEGG(http://www.genome.jp/KEGG/pathway.html)对差异代谢物进行注释，通过差异代谢物对KEGG、PubChem等权威代谢物数据库进行映射，在取得差异代谢物的匹配信息后，对通路数据库进行搜 索和代谢通路分析…-20]。

2结果与分析
2.1质谱分析体系建立
为保证检测过程中的仪器稳定性，在试验中以Q C样品进行质控检测。

结果显示，空白样品无显著 峰,说明物质残留和样品间的交叉污染在可控范围内（图2-A)，Q C样本TIC出峰保留时间和峰面积重叠 很好,说明仪器稳定性很好（图2-B)。

不同样品正反离子流图如图2-C所示，每个不同颜色的质谱峰代 表检测到1个代谢物。

采用无监督的主成分分析方法，得到不同颜色葵花样品的PCA得分图。

4组样品 的数据在PC1维上可以明显区分（图2-D)，3次生物学重复数据能够较好地集中在一起，特别是茎部组 织的样品，数据点几乎重合，表明在试验过程中数据的重现性较好，其中紫茎和白茎位于同一象限,紫花和 白花位于不同象限中。

0PLS-DA得分（图2-E)显示,紫茎和白茎数据点几乎重合，紫花和白花分别位于 不同象限中，因此不同颜色的茎部组织比不同颜色的花组织差异小。

2.2差异代谢物筛选
以‘盐葵4号’的紫色花和紫色茎组织及‘盐葵5号’的白色花和白色茎组织为材料，进行靶向代谢组 分析，共检测到647种代谢物，根据0PLS-DA生成的WP值以及d则验的P值来筛选组间的差异代谢物 (WP>1，且P<0.05)。

紫色花显著高于白色花的代谢物有140种,差异倍数超过5的有23种物质，其中，差异倍数最高的是山奈酚-3-0-戊糖苷，其在紫色花中含量是白色花中的3 499倍（表2)。

紫色花显著 低于白色花的代谢物有224种，其中，差异倍数最高的是尿囊酸，其在白色花中尿囊酸含量是紫色花中的 42 670倍。

紫色茎显著高于白色茎的代谢物有48种，其中，差异倍数最高的是5-苯基-1-戊醇，其在紫色 茎中含量是白色茎中的454倍。

紫色茎显著低于白色茎的代谢物有104种，其中，差异倍数最高的是尿囊 酸，其在白色茎中尿囊酸含量是紫色茎中的6 218倍。

2组样品的差异物质在紫色茎和紫色花中同时上调 的共有17种物质(表3)，在紫色茎和紫色花中同时下调的共有47种物质。

本研究重点关注紫色花形成 的物质代谢机制，所以对紫色花特异差异物质进行了进一步分析，结果表明,在紫色花中特异上调的物质 共有123种,紫茎中特异上调的物质只有31种。

第3期赵君，等:观赏向日葵不同花色物质组成的靶标代谢组学分析
441
qc-01; qc-02;
一 qc-03
正离子模式
负离子模式
_
/
K
'3%-:
\
7
___ qc-01
q c -02««M ^
_ ©Z H -1
ac -03參
Z H -24B ZH -3
\
K
BJ-1 ZJ-1
/
Q C ；
Z J;B J ;
Z H ;BH
-5&+009 -5&+009 -5e+O09 -5&+009 -5e+009 0 le+009 2e+O09 3&+009 4e+009
PC[1]
R 2X [1]=0.656
R 2X [2]=0.308
Ellipse: Hotelling’s T2 (95%)
Q C ；Z J ；B J ;Z H ；BH
图2葵花不同组织的总离子流图以及P C A 和O P L S-D A 得分图
Fig. 2 Total ion current chromatograms in negative and positive ion m odel,and PCA and
OPLS-DA score plots for the different tissues of ornamental sunflower
A.空白样品离子流图;B .质控样品离子流图;C.观赏葵花不同样品总离子流图;D 和E 分别表示观赏葵花不同组织PCA 和OPLS-DA 得分图。

A. Ion currenL chrom aLogram s o! L h e blank conLrol sample ；
B. Ion currenL chrom aLogram s o! L h e qualiLy con Lrol sample ；
C. ToLal ion currenL chrom aLogram s o! L h e diilerenL Lissues o! ornam enLal sunilower；D and E show PCA a^id OPLS-DA scores o! diH erenL Lissues o! ornam enLal sunflower ，respecLively.
QC:质控 Q ualiLy conLrol;qc- 01、qc- 02、qc - 03 代表 1 个样品进行 3 次测定 qc - 01，qc - 02，qc - 03 represenL L h ree deLerm ina- L io n s o! L h e same sample.
.^810^01/^
®
442南京农业大学学报第44卷
表2紫色花（Z H)中代谢物含量高于白色花（B H)的种类
Table 2 Metabolite species with higher content in purple flowers ( Z H) than in white flowers (B H)
代谢物名称
、ame of metabolite V IP
P值
P-value
差异倍数
Fold change
(z u/b u)
山奈酸-3-0-戊糖苷 Kaempferol-3-0-pentoside 1.100.0101 3 499.0山奈酸-7-0-葡萄糖苷Kaempferol-7-0-glucoside 1.170.001 01081.8槲皮素葡萄糖酵酸苷Quercetin glucuronide 1.170.004 0976.0山奈酸-3-0-阿拉伯吡喃糖苷Kaempferol-3-0-arahinopyranoside 1.170.000 2814.4二氢洋槐黄素 Uihydrorohinetin 1.170.004 1379.8酪氣酸、天冬氣酸、丙氣酸Tyr，Asp，Ala 1.170.003 0222.0 5-羧吡喃花青素 3-0-(6’-0-丙二酰-S-吡喃葡糖苷)5-carhoxypyranocyanidin 3-0-(6’-0-malonyl-heta-glucopyranoside) 1.150.008 4175.9 (5xi，9xi，13xi，18xi，19heta)-3-oxolup-20(29)-en-28-oic acid 1.140.0141153.1吡略-2-羧酸Pyrrole-2-carhoxylic acid 1.170.000 3117.5 17-甲基-18-去甲雄甾-4，13(17)-二燦-3-酮17-methyl-18-norandrosta-4，13(17)-dien-3-one 1.170.001 472.3 MLS001076262-01 1.170.001 357.9雌三醇Estriol 1.160.007 450.4、CGC00384888-01 1.160.004 525.6黄樟素Safrole 1.170.000 618.3 211环庚[h]呋喃-7-丙酸，八氢-8-羟基-6,8-二甲基-3-亚甲基-2-，（3aS，6S，8aR)
2U-cyclohepta [ h ] furan-7-propanoic acid，octahydro-8-hydroxy-6，8-dimethyl-3-methylene-2-oxo-，(3aS，6S，8aR)
1.170.003 913.6甲羟孕酮乙酸醋Medroxyprogesteroneacetate 1.160.005 11
2.6环癸[h]呋喃-2(31)-酮，3a，4,5,8,9，11a-六氢-6，10-二甲基-3-亚甲基-，（3aS，6E，10E，11aR)-
Cyclodeca [ h ] furan-2( 31) -one，3a，4,5,8,9，11 a-hexahydro-6，10-dimethyl-3-methylene-，（3aS，6E，10E，11aR)-
1.170.000 311.5 5-[2-(3-糠基）乙基]-8-羟基-5,6,8a-三甲基-3,4,4a，5,6,7,8,8a-八氢-卜萘甲酸
5-[2-(3-furyl)ethyl]-8-hydroxy-5,6,8a-trimethyl-3,4,4a，5,6,7,8,8a-octahydro-1-naphthalenecarhoxylic acid
1.100.037 911.1安眠酮 Axerophthene 1.160.010 38.9 2(4a1)-萘酮，5,6,7,8-四氢-6-羟基-4a，5-二甲基-3-(1-甲基苯基）-，（4aR，5R，6R)-
2(4a1) -naphthalenone，5,6,7,8-tetrahydro-6-hydroxy-4a，5-dimethyl-3 - (1 -methylethenyl )-，(4aR，5R，6R)-
1.170.004 1 6.7 Tetranor-12(S)-1ETE 1.160.009 6 5.9 5-[(E)-2-(4-羟基-3-甲氧基苯基）乙燦基]苯-1，3-二醇 5-[(E)-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)ethenyl]henzene-1，3-diol 1.150.004 8 5.7 1-[4-(p ro p-1-e n-2-y l)环戊基-1-烯基]乙酮1-[4-(prop-1-en-2-yl)cyclopent-1-enyl]ethanone 1.130.019 9 5.6注：代表变量重要性投影值K/P represents variable importance in the projection.下同 The same as follow s.
表3紫色花（Z H)和紫色茎（Z J)中代谢物含量同时上调的种类
Table 3 Significantly up-regulated metabolite species in purple flower(Z H)an d purple ste m(Z J)
Z1_vs_BU ZJ_vs_BJ
代谢物名称
Name of metaholite VIP P值
P-value
差异倍数
Fold change
(z u/b u)
VIP
P值
P-value
差异倍数
Fold change
(z j/b j)
山奈酚-3-0-戊糖 Kaempferol-3-0-pentoside 1.100.010 1 3 498.9 1.140.009 550.2山奈酚-3-0-阿拉伯P比喃糖苷 Kaempferol-3-0-amhinopyranoside 1.170.000 2814.4 1.180.006 829.5二氢洋槐黄素 Dihydrorohinetin 1.170.0041379.8 1.180.037 935.5矢车菊素Cyanidin 1.110.006 9119.8 1.140.029 58.6山奈酚-7-0-葡萄糖苷 Kaempferol-7-0-glucoside 1.170.001 01081.8 1.160.004 525.6环癸[h]呋喃-2(31)-酮，3a，4,5,8,9，11a-六氢-6，10-二甲基-3-亚甲基-(3a S，6E，10E，11aR)
Cyclodeca[h] furan-2(31)-one，3a，4,5, 8,9,11a-hexahydro-6，10-dimethyl-3-methylene-，（3aS，6E，
10E，11aR)
1.170.000 311.5 1.180.012 817.4
5-[2-(3-呋喃基)乙基]-8-羟基-5,6,8a-三甲基-3,4,4a，5,6,7,8,8a-八氢-卜萘甲酸
5-[2-( 3-fmyl ) ethyl ]-8-hyd^-oxy-5，6，8a-trimethyl-3，4，4a，5，6，7，8，8a-octahyd^-o-1-
naphthaleneoaihox^^lic acid
1.100.037 911.1 1.180.038 817.1
Azuleno[4,5-h]呋喃-2(31)-酮，8-(p-D-吡喃吡喃氧基)十氢-6-羟基-6-甲基-3,9-双(亚甲
基）（3aS，6R，6aR，8S，9aR，9h S)-
Azuleno[4,5-h]fumn-2.(31丄）-one，8-(heta-D-gluoopymnosyloxy)deoahyd^o-6-hyd^oxy-6-methyl-3,9-
his (methylene) (3aS，6R，6aR，8S，9aR，9hS)-
1.150.008 3 5.0 1.180.005 2
2.2
Azuleno[6,5-h]呋喃-2,5-二酮，十氢-4a，8-二甲基-3-亚甲基-，（3aR，4aS，7aS，8R，9aS)-
Azuleno [6,5-h] furan-2，5-dione，deoahyd^o-4a，8-dimethyl-3-methylene-，(3aR，4aS，7aS，8R，9aS)-
1.170.000 2 4.9 1.140.011 3
2.2 41-吡喃-4-酮，2-甲基-3-[[6-0-[(2R，3R，4R)-四氢-3,4-二羟基-4-(羟甲基)-2-呋喃基]-
jS-D-P比喃葡萄糖基]氧]-
41-pymn-本one，2.-methyl-3-[[6-0-[(2.R，3R，4R)-tetrahydro-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)-2-
1.160.003 7 4.7 1.180.006 221.0 furanyl ] -heta-D-glucopyranosyl ] ox^:]-
Koparin 2’-甲基醚 Koparin 2.’-methylether 1.110.006 8 4.0 1.140.007 4 2.6
第3期 赵君，等:观赏向日葵不同花色物质组成的靶标代谢组学分析
443
续表 3 Table 3 continued
ZH_vs_BH
ZJ_vs_BJ 代谢物名称Name of metabolite
VIP
P 值P-value 差异倍数Fold change (ZH/BH)
VIP
P 值P-value 差异倍数Fold change (Z J/B J)飞燕草素-3-0_3’,6"-0-二甲酰葡萄糖苷 Delphinidin 3-0-3’,6"-0-dimalonylglucoside 1.160.003 2 3.9 1.180.019 7 1.2花青素3-葡萄糖苷Cyanidin 3-glucoside
1.120.015 2 3.0 1.180.004 6
2.18,11,14-十八碳三蹄酸 8,11,14-octadecatriynoic acid 1.160.000 3 2.1 1.180.007 3 1.9原儿茶酸 Protocatechuic acid 1.070.0162 1.8 1.130.045 6 1.9环己酰亚胺Cycloheximide 1.110.015 8 1.6 1.180.038 4 4.5•〇-色氨酸 D-tryptophan
1.09
0.003 5
1.3
1.14
0.001 0
3.1
2.3差异代谢物的代谢通路分析
将筛选出的差异代谢物映射到KEGG 通路上，并标记在KEGG 通路图上。

分析结果显示,ZH _vS _BH 差异物质共映射到112条代谢通路,ZJ _vs_BJ 差异物质共映射到74条通路。

对ZH_V S _BH 上调物质进行 富集分析，富集程度最显著的途径为丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径，苯丙酸类化合物合成途径，中心 碳代谢，花青素合成等途径（图3-a );ZJ _vS _BJ 上调物质富集最显著的途径为花青素合成途径、嘌呤代谢 途径、玉米素合成等途径（图3-b )。

将紫色茎和紫色花中同时上调的17种物质进行富集分析，结果显示 富集程度最显著的途径为花青素合成途径、恰加斯病途径以及苯丙酸类化合物合成途径（图3-c )。

0.5
Impact
1.0
1
Im pact
Impact
A: Alanine, aspartate and glutamate metabolism ；B : Biosynthesis o f p henylpropanoids ；C: Central carbon metabolism in cancer ；D: Anthocyanm biosynthesis;E: Biosynthesis o f a mino acids;
F: Degradation o f a romatic compounds ；G: Steroid homone biosynthesis ；H: Aminoacyl-tRNA biosynthesis;I: Biosynthesis o f v arious secondary metabolites-part 3; J: Protein digestion and absorption}KrXylene degradation ；Anthocyanin biosynthesis;Purine metabolism ；Zeatin biosynthesis;
Phosphotransferase system (PTS);Metabolic pathways;
Phmylalanme, tyrosine and tryptophan biosynthesis ； Degradation of aromatic compounds ；A: Anthocyanin biosynthesis ；
B : Chagas disease (American trypanosomiasis )；
C: Biosynthesis o f phenylpropanoids ；D : Monobactam biosynthesis ；
E: Toluene degradation ；F: Biosynthesis o f alkaloids derived from ornithine, lysine and nicotinic acid; G: Biosynthesis o f secondary metabolites ；H Naphthalene degradation ；I: Biosynthesis o f p henylpropanoids;J: Microbial metabolism in diverse environments ；
K:Phenylalanine metabolism ；I: Biosynthesis o f a ntibiotics;
J: Central carbon metabolism in cancer ； K:Biosynthesis o f p lant secondary metabolites ；L: Steroid degradation ；
M: Biosynthesis o f p lant secondary metabolites ； N: Metabolic pathways
L : Biosynthesis o f s econdary metabolites ； M: Xylene degradation ；N ： ABC transporters L : A BC transporters ；M: Microbial metabolism in diverse environments; N: Metabolic pathways
图3差异代谢物通路聚类分析
Fig. 3 Cluster analysis of differential metabolite pathway
a. ZH_vs_BH 上调差异代谢物通路分析;
b.ZJ_vs_BJ 上调差异代谢物通路分析;
c.ZH_vs_BH 和ZJ_vs_BJ 共同上调 差异代谢物通路分析。

a. Cluster analysis of up-regulated differential metabolite pathway for group ZH_vs_BH;b. Cluster analysis of up-regulated differential metabolite pathway for group ZJ_vs_BJ ；c. Cluster analysis of com m on up-regulated differential metabolite pathway for group ZH_vs_BH and ZJ_vs_BJ.
本研究主要是分析紫色花向日葵形成的相关代谢物质，而已有研究表明，紫色花形成的主要花色素是 花青素[6]，所以重点对花青素合成途径进行分析。

在本研究中，差异代谢物中参与花青素合成途径的有 矢车菊素（cyanidin )、矢车菊素-3-0-葡萄糖昔（cyanidin 3-glucoside )和飞燕草素-3-0-3’,6"-〇-一■甲酿 葡萄糖昔（delphinidin 3-0-3’,6"-0-dimalonylglucoside );本研究还分析了参与其他颜色呈色的黄麵和黄麵 醇生物合成途径中的物质，其中参与其他黄酮和黄酮醇生物合成途径且存在差异的物质共有5种,分别是 槲■皮素（quercetin )、黄苗喊（astragalin )、异槲■皮素（isoquercitrin )、杨梅素（myricetin )以及芦丁（rutin ),这 5种物质在紫花中的含量相比白花显著下降(表4)。

将以上相关物质对应到黄酮类物质以及花青素合成代谢通路中,结果表明部分黄酮类物质的合成下 调，花青素类物质合成上调可能是紫花花色形成的主要物质基础（图4)。

444南京农业大学学报第44卷
表4黄酮和黄酮醇生物合成途径中下调代谢物质
Table 4 Down-regulated metabolites in the flavone and flavonol biosynthesis
代谢物质Name of metabolite
ZH_vs_BH 下调 D tnw n-regulation ZJ_vs_BJ 下调 D tnw n-regulation
V IP
P值
P-value
差异倍数
Fold change (ZH/BH)
VIP
P值
P-value
差异倍数
Fold change(ZJ/BJ)
樹皮素Quercetin 1.160.039 70.52 1.180.031 30.17
黄芪减 Astragalin 1.130.006 60.38 1.180.010 30.19
异樹皮苷 Isoquercitrin 1.140.001 50.67 1.160.031 70.21
芦丁 Rutin 1.060.028 20.63 1.180.00100.42
杨梅素M yricetin 1.170.047 80.77 1.140.01120.50
图4与花色相关的物质代谢途径
Fig. 4 The metabolic pathway of substances related to flower color
向上箭头显示该物质上调，向下箭头显示该物质下调。

方框中数字为酶复合物编号。

The up arrow indicates that the substance is up-regulated,and the dow n arrow indicates that the substance is down-regulated.
The number in the box is enzym e compound number.
3讨论
广泛靶向代谢组学是结合非靶向代谢组学和靶向代谢组学的优点，该方法基于广泛靶向代谢组数据 库，利用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM)模型，定性、定量检测样本中代谢物含量，具有高 效、高灵敏、高覆盖的特点[&14]。

因此，利用广泛靶向代谢组学对植物中花色素相关代谢产物进行鉴定与 分析，可以深人解析植物不同花色形成的物质基础。

本研究中，不同颜色花组织中差异代谢物数量显著多于不同颜色的茎组织，但是紫色组织共同上调的 代谢物只有17种，这可能存在以下几方面原因：1)不同植物组织之间代谢物含量存在较大差异。

本研究 的花组织样品包括颜色存在显著差异的管状花、雌蕊以及萼片的顶端，是3个不同部位的混合样品；而茎 只是不同颜色的单一组织。

2)不同品种间存在差异。

连续多年种植结果表明‘盐葵4号’在长势、抗病性 方面显著优于‘盐葵5号’，但熟性显著晚于‘盐葵5号’。

尿囊酸是植物氮素主要利用和储存形态[21」。

本研究结果显示尿囊素含量在2个品种中存在极显著差异，这表明，‘盐葵5号’的氮素吸收效率要高于 ‘盐葵4号’，在生长过程中植物体内物质的代谢速度显著高于‘盐葵4号’。

3)花部组织颜色较茎部组织 的颜色深，花部组织和茎部组织中与颜色相关代谢物质的数量和含量存在较大差异。

在比较不同差异代 谢物在花和茎组织中的差异倍数时，大部分差异代谢物在不同颜色的花组织中差异倍数都显著高于不同 颜色的茎组织，这表明不同颜色花组织在颜色形成过程中参与的代谢物质数量及峰度都显著高于茎部组 织，这从矢车菊素在花部组织差异倍数显著高于茎部组织这一结果得到验证。

类黄酮是控制花色的主要色素之一，其中花青苷是类黄酮的重要组成成分[s]。

矢车菊素是花青苷中 的主要成员，是花色素中呈现紫色的主要色素之一，而白色花呈色的主要色素则为“黄酮类或/和其他 苷”[5]。

在本研究中，紫色花和紫色茎中矢车菊素含量显著高于白色花和白色茎中的含量，而且紫色较深 的‘盐葵4号’花组织矢车菊素含量显著高于颜色较浅的茎部组织，而紫色花和紫色茎中部分黄酮类物质
第3期赵君，等:观赏向日葵不同花色物质组成的靶标代谢组学分析445
含量显著低于白色花和白色茎中的含量。

该结果暗示‘盐葵4号’紫色组织呈色过程中，花青素合成途径 扮演关键角色，矢车菊素是‘盐葵4号’紫色组织呈色的主要物质。

山奈酚及山奈酚衍生物属于类黄酮类 物质,在植物不同组织的颜色形成过程中具有重要作用。

乔雨等[22]以不同颜色的蒙农红豆草为材料，对 不同颜色花瓣色素种类及含量进行综合分析,结果表明芦丁、山奈酚-3-芸香苷-5-鼠李糖苷和山奈酚- 3-p-香豆酰葡萄糖苷为影响蒙农红豆草花色变化的主要成分。

钟培星等[23]以开花不同时间段花色存在 显著变化的野生芍药为材料,定性定量分析其花色素组分，共监测到47种类黄酮成分,其中有12种山奈 酚衍生物。

在本研究中,检测到3种山奈酚类差异代谢物,分别是山奈酚-3-0-戊糖苷（kaempferol-3-O-pentoside)、山奈酚-3- 〇-阿拉伯吡喃糖苷（kaempferol-3-O-arabinopyranoside)、山奈酚-7-0-葡萄糖苷 (kaempferol-7-0-glu(:oside)。

这3种山奈酚类代谢物含量在不同颜色的组织中差异非常大,表明山奈酚类 物质可能在‘盐葵4号’紫色组织形成过程中扮演重要角色，但是，目前山奈酚衍生物参与植物组织颜色 形成还没有详细和确切的报道，因此进一步分析山奈酚衍生物在参与植物组织颜色形成过程中的作用将 是本研究今后的重点工作。

本研究通过代谢组学解析观赏葵花不同组织呈色的代谢物组成差异，但是并没有分析差异代谢物的 遗传机制。

在下一步研究中，将结合转录组分析，进一步分析代谢物组成差异及花色形成的分子基础，为 通过分子手段改良植物花色提供理论支持。

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