HPLC-ELSD 法测定滋肾通关胶囊中2种知母皂苷类成分

HPLC-ELSD 法测定滋肾通关胶囊中2种知母皂苷类成分倪文澎;朱敏;周琴妹
【摘要】目的：采用 HPLC-ELSD 法测定滋肾通关胶囊中知母皂苷BⅡ、AⅢ的含量,为其质量标准的建立提供依据.方法：采用 Kromasil C18色谱柱
(4.6mm×250mm,5μm),以乙腈-水为流动相梯度洗脱,流速为1.0mL/min,漂移管温度为115℃,载气流速为3L/min.结果：知母皂苷BⅡ和AⅢ进样量分别在
0.53~21.28μg 和0.54~21.36μg 范围内呈良好的线性关系,精密度、重复性、稳定性的 RSD 均低于3%,加样回收率为103.9%和98.7%,滋肾通关胶囊中知母皂苷BⅡ和AⅢ的含量分别为0.44%和0.32%,知母药材中这两种成分的含量分别为1.19%和0.59%.结论：本研究建立了同时测定滋肾通关胶囊及知母药材中知母皂苷BⅡ和AⅢ含量的方法,为滋肾通关胶囊及知母药材质量标准的建立和完善提供了参考.
【期刊名称】《江苏中医药》
【年(卷),期】2012(000)011
【总页数】2页(P69-70)
【关键词】滋肾通关胶囊;知母;知母皂苷BⅡ;知母皂苷AⅢ;HPLC-ELSD
【作者】倪文澎;朱敏;周琴妹
【作者单位】江苏省中医院,江苏南京 210029;江苏省中医院,江苏南京 210029;江苏省中医院,江苏南京 210029
【正文语种】中文
【中图分类】R289.5
滋肾通关胶囊由知母、黄柏、肉桂三味常用中药组成，方出金·李东垣的《兰室秘藏》，具有滋肾清热、化气通关之功效。

滋肾通关胶囊是将处方中黄柏、知母用适当浓度乙醇提取，加肉桂细粉后制胶囊剂而得，使服用量少而含药量高，从而保证临床疗效。

知母中知母皂苷BⅡ和AⅢ在知母药材中含量均较高，且具有改善记忆障碍，诱发肿瘤细胞凋亡，抗血栓等活性，是治疗老年性痴呆、心血管疾病、抗癌的有效成分[1-6]。

本研究采用HPLCELSD法测定滋肾通关胶囊中知母皂苷BⅡ和
AⅢ的含量，为进一步完善该制剂的质量标准提供参考。

1 仪器与试药
Waters 2695高效液相色谱仪，Alltech 2000ES蒸发光散色检测器，Empower
色谱工作站，KQ-1000E医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），
TG16-WS台式高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司），乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），纯净水（娃哈哈），1/10万电子天平（BP-211D型，sartorius），其余试剂均为分析纯。

知母皂苷BⅡ （Timosaponin BⅡ，批号：20 110318）、知母皂苷AⅢ（Timosaponin AⅢ，批号：20 110426）均购自上海源叶生物科技有限公司
（纯度均大于98%）。

知母药材购自江苏省药材公司（批号 110326），经江苏
省中医院周琴妹主任中药师鉴定为百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）的干燥根茎，饮片样品标本存于江苏省中医院中药制剂实
验室。

滋肾通关胶囊（江苏省中医院制剂，批号： 100020）。

2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱：kromasil C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-水（B）；梯度洗脱（0、15、25、35、45、55min，10%、20%、
25%、35%、50%、70%A）；流速：1mL/min；柱温：（30±5）℃；漂移管温度：115℃；载气流速：3L/min。

2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备分别精密称取对照品知母皂苷BⅡ、AⅢ适量，用30%乙腈水溶液溶解并制成每1mL含知母皂苷BⅡ1064μg、知母皂苷AⅢ 1068μg的
对照品储备液，精密吸取上述储备液各300μL成混合标准品溶液，即制得每1mL 含知母皂苷BⅡ532μg、AⅢ 534μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备精密称取知母饮片粗粉和滋肾通关胶囊内容物各1.000g，加入30%乙腈50mL，精密称定，超声30min，取出放至室温，补足重量，摇匀，静置，取续滤液，13000r/min，离心5min后取上清进样。

2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系分别精密吸取上述混合对照品溶液 1、5、10、20、40μL，在“2.1”项中色谱条件下进样测定，以知母皂苷BⅡ和AⅢ进样质量的对数值
logM为横坐标，相应峰面积的对数值logA为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程，结果见表1。

表1 两种知母皂苷类成分的线性关系（n=3）
2.3.2 精密度精密吸取混合对照品溶液10μL，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，以色谱峰面积计算，知母皂苷BⅡ的RSD为2.4%，知母皂苷AⅢ的RSD为
1.9%，结果表明精密度良好。

2.3.3 稳定性分别于配制后 0、2、4、6、12、24h测定供试品溶液，计算所测色谱峰面积的RSD值，滋肾通关胶囊内容物和知母饮片粉末中知母皂苷BⅡ、AⅢ
的RSD分别为2.8%、2.1%和1.7%、2.5%，结果表明24h内这两种成分在滋肾
通关胶囊和知母饮片中较稳定。

2.3.4 重复性取同一批的滋肾通关胶囊和知母饮片粉末各6份，按上述方法制备供
试品溶液，分别进样10μL，按上述色谱条件测定知母皂苷BⅡ和AⅢ的含量。

结果表明，这两种成分在滋肾通关胶囊及知母饮片中含量的RSD值分别为2.0%和
1.6%，表明本方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率称取已知含量的滋肾通关胶囊内容物6份，每份0.5g，精密称定，依据样品中知母皂苷BⅡ和AⅢ的含量，精密加入等质量的对照品溶液，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备的方法制备样品，测定含量。

结果显示，知母皂苷BⅡ和AⅢ的平均加样回收率（n=6）和RSD分别为103.9%，1.8%；98.7%，2.7%。

2.4 样品的测定取滋肾通关胶囊内容物及知母饮片粉末各3份，每份1.000g，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行含量测定，测定结果见表2和图1。

3 讨论
从本研究结果看，知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ这两种成分在滋肾通关胶囊中均存在，但其含量较知母饮片低，这可能与制剂提取加工过程及方法有关。

由图1可以看出，知母饮片中的知母皂苷BⅡ与相邻峰分离度不佳，造成该结果的原因有两个：知母饮片的供试液浓度过高，流动相条件没有探索到最佳。

在以后的实验中我们将考虑调整饮片供试液浓度，同时继续对流动相条件进行探索，以找到最优液相条件。

表2 样品含量测定结果（n=3） %
图1 样品及对照品HPLC-ELSD色谱图注：A.知母饮片，B.滋肾通关胶囊，C.混合对照品；1.知母皂苷BⅡ，2.知母皂苷AⅢ。

目前，知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ是否是滋肾通关胶囊中的活性成分还需要深入的探讨。

本研究中采用HPLC-ELSD测定了这两种成分在滋肾通关胶囊中的含量，为后续滋肾通关胶囊功效物质基础的深入研究提供了参考，也为该制剂质量标准的
制定和完善提供了依据。

4 参考文献
[1]原源，陈万生，孙连娜，等.知母商品药材中的皂苷类成分含量测定.中国医院药学杂志，2006，26（6）：656
[2]李素燕，赵振虎，裴海云，等.知母皂苷AⅢ抗血栓作用研究.军事医学科学院院刊，2006，30（4）：340
[3]Wen-Quan Lu，Yan Qiu，Tie-Jun Li，et al.Antiplatelet and antithrombotic activities of timosaponin B-II，an extract of Anemarrhena asphodeloides.Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology，2011，38：430
[4]Wen-Quan Lu，Yan Qiu，Tie-Jun Li，et al.Timosaponin B-II Inhibits Pro-inflammatory Cytokine Induction by Lipopolysaccharide in BV2 Cells.Arch Pharm Res，2009，32（9）：1301
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[6]王颖异，郭宝林，张立军.知母化学成分的药理研究进展.科技导报，2010，28（12）：110。