发酵实验报告二、根霉曲糖化能力的测定

发酵工程学实验报告实验二根霉曲糖化能力的测定
学院生命科学学院
专业应用生物教育
班级12应生A班
姓名李顺昌
学号124120218
实验课程根霉曲的制备
指导教师许波
开课学期2014—2015学年下学期
实验二根霉曲糖化能力的测定小组合作：是小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤
一、实验目的
1.了解标准曲线的制作和使用方法
2.掌握DNS（3,5-二硝基水杨酸）法测定糖化酶活力的基本原理和方法
3.学会计算糖化酶的糖化DE
二、实验设备与材料
1.设备：天平、烧杯、三角瓶、水浴锅、离心机、722分光光度计等
2.材料：根霉曲、柠檬酸缓冲液、DNS、0.1%葡萄糖溶液、1%淀粉溶液
三、实验原理
1.淀粉：由葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直链淀粉和α-1,6位有分支的支链淀粉组成，其水解需淀粉酶和糖化酶的作用；
淀粉酶的作用：首先酶解淀粉为小分子的糊精、寡糖和少量单糖；
糖化酶的作用：其次通过糖化酶的作用将小分子的糊精和寡糖降解为还原性的单糖。

2.DNS法：利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。

3.DE（Dextrose Equivalent，葡萄糖值）：是糖化液中还原糖（以葡萄糖计）占干物质的百分比，工业上用DE值表示淀粉的水解程度或糖化程度。

四、实验方法步骤
1.绘制标准曲线的方法
先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长
下分别测定吸光度A。

以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。

然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。

2.待测酶液的制备
烘干：把发酵产物倒于平皿中，50℃烘干；
制备酶粉：将烘干的发酵产物用研钵研磨成粉状（尽量磨细），装于塑料袋中备用；
制备酶液：称取1g根霉曲粉，充分溶解于30mL缓冲液(即稀释30倍)，纱布（4层）过滤去除杂质，滤液备用。

3.糖化酶酶活测定方法
酶活定义：在50℃、pH4.8条件下，每分钟内每毫升酶液降解淀粉底物产生1μmoL葡萄糖所需要的酶量定义为一个国际单位（IU）。

酶活计算公式：酶活(IU)=(K×OD+b) ×N ×1000/180.2/0.2/10
K: 标准曲线的斜率；N：稀释倍数；1000：转换因子1mg=1000μg
180.2：葡萄糖分子量；0.2：酶液体积；10：反应时间（min）
4.糖化DE值的计算
DE%=还原糖含量/淀粉含量×100
计算公式=(K×OD+b)*15/（1.8 ×1% ×1000) ×100
5.淀粉酶的液化效果检测
6.试验注意事项
试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；
移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！
精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时。

五、实验报告
（一）实验现象、数据及结果
1.标准曲线测量结果
葡萄糖溶液体（ml）0.00.20.40.60.8 1.0 1.2葡萄糖含量（mg）0.00.20.40.60.8 1.0 1.2缓冲液（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.00.8 DNS (ml)3333333
沸水浴煮沸
5min
流水冷却,加蒸馏水
10mL ，混匀
定容总体积(ml)
15 15 15 15 15 15 15 OD （540nm ） 0.084 0.103 0.415 0.484 0.792 1.036 1.095
葡萄糖标准曲线如上图所示，得回归直线方程y=0.9421x+0.0074，k=0.9421，R2=0.9673。

式中Y 表示测定的吸光度（OD ）值，X 表示葡萄糖的浓度。

2.糖化酶活力测定现象和结果
3.酶活力单位计算
酶活(IU)=(K ×（ODa+ODb ）/2+b) ×N ×1000/180.2/0.2/10
=（0.9421×（0.182+0.179）/2+0.0074）×30×1000/180.2/0.2/10 =14.771 试管编号 C 试管 A 试管
B 试管 OD （540nm ） 0.00
0.182 0.179
4.糖化DE值的计算
DE%=(K×（ODa+ODb）/2+b)*15/（1.8 ×1% ×1000) ×100
=（0.9421×（0.182+0.179）/2+0.0074）*15/（1.8 ×1% ×1000) ×100 =14.7874
5.淀粉酶的液化效果检测
当向加酶液的试管加入碘液时，试管中溶液没有明显的颜色的变化，说明试管中的淀粉已经被酶液所分解，所以加碘液就不会变色；而没有加酶液的试管中溶液变成了蓝色，说明试管中有淀粉的存在，淀粉没有消失。

（二）分析与讨论
根据实验结果和我们所查阅的文献对比，我们实验的所测得的根曲霉糖化活性偏低。

分析可能是以下原因造成的：
1、酶的活性受温度、pH等多种因素影响，本次试验只是简单地验证性实验，并未严格控制实验条件，故而测定得到的数据误差较大。

2、糖化酶是诱导酶。

当培养环境中淀粉的含量较高时，会诱导微生物形成较多的糖化酶，而本次实验培养时，我们仅仅使用了麦麸，对根曲霉中的糖化酶诱导不够，所以在测定时反应出活性较低。

3、我们在实验过程的研磨、溶解、吸取、滴定等操作存在一定的误差，在待测酶液的制备时，可能由于实验操作原因，导致糖化酶没有完全浸出，导致实验结果有所偏差，故而导致测定活性较低。

（三）结论
根据实验结果来看，已初步得到具有糖化活性的根曲霉，首先证实了根曲霉的培养成功，其次证明了所培养的根曲霉具有糖化活性，能够分解淀粉产生葡萄糖，已基本达到实验目的。

（四）实验总结
1、本次实验成败之处及其原因分析
(1)小组成员分工明确，又团结协作，组员实验动手能力强。

(2)通过老师讲解，我们明白了根酶曲糖化活力测定的原理，掌握了酶
活力的测定方法与酶活单位的定义、意义，明确了实验步骤，再加上实验步骤简单，我们在实验过程中信心满满。

(3)由于酶的反应特殊性与复杂综合因素影响因此在酶活力测定过程中，为了减少误差，应该熟悉掌握操作过程，对影响到的诸多因素严格控制，如：对温度严格控制，为了减少视觉误差造成的影响，还可进行实验预滴定。

2、本实验的关键环节及改进措施
①做好本实验需要把握的关键环节；
称量酶粉时要准确，加热时时间要准确；量取酶液和缓冲液时体积要精确。

②若重做本实验，为实现预期效果，仪器操作和实验步骤应如何改善。

酶的活性受时间、温度、pH等因素影响较大，所以在实验过程中应严格控制相关影响因素，其次在加缓冲液和酶液时一定要量取准确，加热时时间要精确，这样才能完美的控制酶促反应的结束，尽量避免人为误差。

3、对实验的自我评价
在本次实验中我积极认真，积极参与到了实验过程中，与小组成员团结合作，熟悉了根酶曲的简单制作，加强了实验动手能力，通过根酶曲的制作及酶活力的简单测定，加强了“无菌”操作的概念，了解根酶曲糖化活力测定的原理，掌握了酶活力的测定方法与酶活单位的定义、意义。

在实验过程中，我有不懂的能够及时向同学或者老师请教，把问题在实验室就解决了，没有遗留到课后，这次实验课我收获良多。