木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告

木瓜蛋白酶的分离纯化
一、目的
（1）它是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁中提取粗酶液，并进一步纯化，获得高纯度的木瓜蛋白酶。

（2）通过此次试验，熟悉掌握木瓜蛋口酶分离纯化的基本步骤和原理，了解离心分离，萃取等实验技术。

二、原理
木瓜蛋口酶（Papain ）是一种毓基蛋白酶，它分解比胰脏蛋口水解酶更多、更广泛的蛋白底物。

它也具有脂酶活力。

其分子量约为23000 左右。

在25 °C , pH6. 2时，1分钟生成lumol酪氨酸的酶量为1 单位。

木瓜蛋白酶是单条肽链，有211氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有1个疏基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和EDTA ；抑制剂有铳基试剂，包括重金属和竣基试剂和过氧化氢。

酪蛋口是一种蛋口质，它被木瓜蛋口酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm处有吸收峰，根据测定275nm处的吸收值，可以判定木瓜蛋口酶的酶活力。

吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋口酶分解的酪蛋口多，酶活力高。

三、实验材料
番木瓜汁；PEG （聚乙二醇，分子量为6000）；（NH5）2SO1；三氯乙酸
（TCA）；酪氨酸；考马斯亮蓝
四、仪器设备
（1 ）离心机4000-lOOOrpm （冷冻式或非冷冻式）
（2 ）752紫外分光光度计
（3 ）水浴箱
（4 ）冰箱
（5 ）榨汁机
五、玻璃器皿（以组为单位）
试管（6 ） , 100 mL烧杯（2 ）,吸管（1 ）、玻棒（1 ）,
试剂瓶（1000 mL、500 mL、250 mL等），移液管或移液器5mL （l）、lmL（2）、0. 5mL （ 1 ）,漏斗（3 ）,滤纸（3-6 ）等六、实验试剂配制及实验步骤
氨酸的标准曲线
试管编号01234一
标准酪氨酸溶液（ml ）00.20.40.60.8 1.0蒸馅水（ml ）2 1.8 1.6 1.4 1.21
紫外吸光度A275nm00. 0660. 1750. 3000.4300. 550
将上述各管混匀，静置2min,测定各管的A275nm,做标准曲线,
曲线如下：
酪氨酸曲线
（二）粗酶活测定
1试剂
（1）3mg/ml木瓜蛋白酶液（用0. lmol/L的磷酸缓冲液，pH 7. 2 配制）
（2 ） 0. lmol/L的磷酸缓冲液，pH 7.2
（3 ）用0. lmol/L磷酸缓冲液（pH 7. 2 ）配制含80mmol/L半胱氨酸
（4）1%酪蛋白溶液：用0. lmol/L磷酸缓冲液（pH7.2 ）配制
（5 ）15%三氯乙酸（TCA ）溶液
2方法
量取酶液0.2 mL,加入激活剂0.25 mL于带塞试管中，在37°C水浴
中保温8 min,吸取预热37°C酪蛋白液（质量分数为1%） 1 mL加入此管，在37°C水浴中反应10 min,加入三氯乙酸（TCA） 2 mL摇匀, 静置5 min；另取样液（己激活）0.3 mL置另一带塞试管中，加入
TCA 2 mL, 37°C保温10 min后，加入预热至37°C的酪蛋白液1 mL, 静置5 min,测2个管的A275 nm值，同时做2个平行试验。

（三）纯化
固定体系总质量为20. 5 g,在PEG （分子量6 000）质量分数为22. 0%, （NH4）2SO4质量分数为14.6%, pH值为5.0,粗酶添加量为7. 5%所组成的双水相体系下，室温下静置分相后，读取上、下相体积, 计算相体积比R,分别测定上、下相的酶活力
（四）计算与结果
9/17 二0. 529
粗酶活二(0. 103 - 0.0139) /10. 496/181.2 * 100000 / 0. 03 =
156. 16
上相酶活=(0. 32 - 0.0139 ) /10. 496/181. 2 * 100000 / 0. 02 =
804.7
下相酶活=(0. 02 - 0. 0139) /10. 496/181. 2 * 100000 / 0. 012 二
26. 7
酶分配系数二上相酶活/下相酶活二804. 7 / 26. 7 = 30. 14。