三氯乙烯致敏豚鼠肝脏损害研究

Liver d amage i nduced
b y t richloroethylene i n s ensitized g uinea p igs
【摘要】 目的： 观察三氯乙烯 (trichloroethylene，TCE)致敏豚鼠的肝脏功能改变和超微结构变化。

方法：选用体质量250~300 g 的白色雌性豚鼠，随机分成空白对照组，溶剂 (橄榄油)对照组，TCE处理组(包括TCE致敏24 h 、72 h 组和TCE未致敏24 h 、72 h 组)。

根据豚鼠最大值试验 (guinea p ig m aximization t est，GPMT)法进行处理，在终末激发后24 h 和72 h 心脏采血，用全自动生化分析仪测定血清中谷丙转移酶(ALT)、谷草转移酶(AST)、总蛋白 (TP)、白蛋白 (ALB)、球蛋白 (GLB)、白球比值 (A/G)等肝功能指标，无菌条件下取肝组织进行病理学和超微结构检查。

结果：TCE 处理组致敏率为65.38%。

TCE致敏72 h 组ALT和AST水平比TCE致敏24 h 组和TCE未致敏72 h 组均升高 (P 均<0.05)；TCE致敏72 h 组ALB水平比溶剂对照组和TCE未致敏72 h 组降低 (P <0.05)。

病理检查显示TCE致敏72 h组中见到较多肝细胞水肿，并有胞核破裂消失。

透射电镜 观察显示TCE未致敏组可见少数线粒体空泡、变性，粗面内质网减少；TCE致敏组肝脏细胞中线粒体空泡、变性、数量减少，粗面内质网断裂、扩张、糖原颗粒明显减少；且在末次激发后72 h 组比24 h组的损害更严重。

结论：TCE处理组豚鼠体内发生了肝脏功能障碍和超微结构的破坏，且损伤的程度随着时间的延长而加重。

【关键词】 三 氯乙烯；豚鼠；肝脏；损害
中图分类号： R 135.7；R994.6 文献标识码： A 文章编号： 1004-616X(2011)05-0344-05 d oi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2011.05.005
【ABSTRACT 】 OBJECTIVE: To observe the changes of liver function and ultrastructures induced by trichloroethylene i n s ensitized g uinea p igs. M ETHODS ： W hite f emale g uinea p igs (250-300 g ) w ere r andomly d ivided into b lank c ontrol g roup， s olvent (olive o il) c ontrol g roup a nd T CE t reatment g roup. G uinea p igs w ere t reated w ith g uinea pig m aximization t est (GPMT). S pecimens w ere c ollected a t 24 h a nd 72 h a fter l ast s timulation， l iver t issue p athology a nd ultrastructures e xamined，and A ST，ALT，TP，ALB，GLB a nd A /G i n s erum m easured. R ESULTS ： S ensitization rates w ere 65.38% i n T CE t reatment g roups. C ompared w ith T CE s ensitized 24 h g roup a nd T CE n on-sensitized 72 h group， A LT a nd A ST l evels i n T CE s ensitized 72 h g roup i ncreased s ignificantly(P <0.05). C ompared w ith s olvent g roup and T CE n on-sensitized 72 h g roup， A LB l evels i n T CE s ensitized 72 h g roup i ncreased s ignificantly(P <0.05). T CE sensitized group 72 h revealed more edema in liver cells with nucleus ruptured and disintegrated. TEM observation showed： a f ew m itochondria v acuoles， d egeneration， r ough e ndoplasmic r eticulum d ecreased i n T CE n on-sensitized group. T CE s ensitized g roup d emonstrated r eduction i n t he n umber o f m itochondria i n l iver c ells， r ough e ndoplasmic reticulum f racture， e xpansion， d ecreased g lycogen g ranules. I n t he g roup o f 72 h a fter t he l ast c hallenge，more s erious damage w as v isible t han t hose i n 24 h g roup. C ONCLUSION ： L iver d ysfunction a nd u ltrastructural d amage o ccurred i n sensitized g uinea p igs i nduced b y t richloroethylene. T he e xtent o f i njury g radually i ncrease w ith t ime.
【KEY W ORDS 】 t richloroethylene；guinea p igs；liver；injury
三氯乙烯致敏豚鼠肝脏损害研究
1，2112
朱启星/徐 辉/冷 静/沈 彤( 1. 安徽医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生
系，安徽 合肥 230032；2. 安徽医科大学皮肤病研究所，安徽 合肥 230032 )
1，2112
ZHU Qi-xing ，XU Hui ，LENG Jing ，SHEN Tong (1．Department of Occupational and Environmental Hygiene, School of Public Health , Anhui Medical University, Hefei 230032;
2．Institute of Dermatology ，Anhui Medical University, Hefei
230032, Anhui, China )
收稿日期： 2011-05-23； 修订日期：2011-07-07
基金项目： 国家自然科学基金资助项目(30872147)；教育部科学技术研究重
点项目(210100)；安徽省自然科学基金项目(11040606M213)；安徽高校省级自然科学研究重点项目(KJ2009A73)
作者简介： 朱启星 (1958- )，男，教授，博士研究生导师，研究方向：皮
肤毒理学，E-mail：***************
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３４４
三氯乙烯(trichloroethylene， T CE)为不饱和卤代烃毛，大小4 c m×6 c m。

将豚鼠颈背部去毛区从头向尾类化合物，是一种无色易挥发液体，有类似氯仿的气依次设L1、R1、L2、R2、L3、R3共3对6个点，各点味，分子量为131.4，沸点为86.7 ℃，易溶于乙醇、乙间距1.5 cm，各对间距3 cm。

第1天TCE实验组L1、醚等有机溶剂，不溶于水，具有较强的脱脂作用，常R1两点注射0.1 m l弗氏完全佐剂(FCA)，L2、R2两点用用作金属去脂剂、除油剂、有机溶剂和斑点去污剂5% T CE(TCE∶橄榄油＝5∶95) 0.1 m l皮内注射进行初等，在五金、电子、玩具、造纸、印刷、有机合成等次致敏，L3、R3两点注射0.1 m l F CA与5%TCE的等量行业应用广泛。

目前，动物实验已确认TCE存在致癌混合物；空白对照组不做任何处理；溶剂对照组L1、性，国际癌症研究中心(International A gency f or R esearch R1两点注射0.1 m l F CA ，L2、R2两点注射0.1 m l橄榄on C ancer，IARC)于1995年将TCE从Ⅲ类(非人类致癌油，L3、R3两点注射0.1 m l F CA和橄榄油的等量混合物)划分至Ⅱ类(人类可能致癌物)。

由于TCE的易挥发物。

第8天，TCE组用40% T CE涂皮，然后用两层纱性和脂溶性，在职业接触中，TCE主要经呼吸道、皮布，一层玻璃纸覆盖，无刺激胶布封固48 h进行第2次肤和消化道进入体内，容易蓄积于肝、脑、心脏等器诱导致敏，溶剂对照组涂橄榄油。

48 h后用生理盐水官，引起皮肤、肝脏、肾脏等多脏器及神经系统的损清洗。

第15天，实验前24 h将豚鼠躯干部去毛，TCE组[1-2]用20%TCE涂抹进行激发，方法同第8天时的处理。

24 害。

TCE可致部分接触工人产生药疹样皮炎，称为
h后用生理盐水清洗，观察皮肤反应。

末次激发24 h和三氯乙烯药疹样皮炎(dermatitis m edicamentosa-like o f
72 h时心脏采血，处死动物无菌条件下取肝组织。

trichloroethylene， D MLT)。

DMLT 患者往往伴有严重的
1.2.2 视觉评分末次激发后24 h依据《化学品毒性鉴肝损伤，继发的肝、肾多脏器损伤往往是DMLT患者
定技术规范》(卫监督发【2005】272号)中的评分标死亡的直接原因，但是目前关于TCE致肝损伤的相关
准：无反应记0分，散在或小块红斑记1分，中度弥漫病理学研究较少。

为此，本研究采用豚鼠最大值试验
的红斑、轻度水肿记为2分。

观察和记录豚鼠背部受(guinea p ig m aximization t est， G PMT) 法建立动物模型，
试区的皮肤反应情况，进行评分。

当试验动物皮肤反观察TCE致敏豚鼠的肝脏功能改变和超微结构变化，
应积分≥1时，判为皮肤致敏反应阳性。

为TCE致肝损伤的进一步研究提供理论依据。

1.2.3 血清中肝功能指标的测定将采集的豚鼠全血，
3 000 r/min离心15 m in，分离血清。

全自动生化分析仪上1 材料与方法
检测肝功能，包括谷丙转移酶(alanine a miotransferase， 1.1 主要试剂与仪器
ALT)、谷草转移酶(aspartate t ransaminase， A ST)、总蛋白三氯乙烯、弗氏完全佐剂 (FCA) (美国Sigma公
(total protein， TP)、白蛋白 (albumin， ALB)、球蛋白 司)，十二烷基硫酸钠(SDS) (上海化学试剂采购站，日
(globulin， G LB)、白球比值(albumin /g lobulin， A/G)。

本进口分装产品)，橄榄油(中国医药上海化学试剂公
1.2.4 肝组织病理学检查除去肝脏结缔组织及脂司)，无刺激性胶布(Neoplast公司)，肝功能试剂盒由安
肪，于10%福尔马林固定，脱水，石蜡包埋。

组织蜡徽医科大学第一附属医院检验科提供，超微结构检测
块在切片机下连续切片，厚度为3 μm，进行HE染所需试剂由安徽省立医院病理科提供。

低温高速离心
色，光镜下观察组织形态。

机(德国Hettich U niwersal 320/320R)，全自动生化分析
1.2.5 肝组织超微结构检查除去肝脏结缔组织及脂仪(瑞士Roche公司Modular D PP)， J EM-1230型透射电
肪，用0.1 mol/L戊二醛-多聚甲醛混合缓冲固定液子显微镜(日本JEOL公司)。

(Karno)固定8~10 h后，常规梯度乙醇脱水，环氧树脂1.2 实验方法
(EPON812)包埋，制成超薄切片，透射电镜观察摄片。

1.2.1 动物分组和处理将体质量为250~300 g的白色
雌性豚鼠适应性饲养5~7 d后随机分成空白对照组(5 1.3 统计学分析
应用SPSS 13.0软件进行分析，所有计量资料均以只)、溶剂对照组(5只)、TCE实验组(26只，其中末次激
-(x±s)表示，各组间的差异用单因素方差分析，采用发后24 h组12只；末次激发后72 h组14只)。

用豚鼠最
LSD法，检验水准取α=0.05。

大值试验(GPMT)方法建立动物致敏模型，根据致敏结
果和处理时间将TCE处理组分为TCE致敏24 h组、
TCE致敏72 h组和TCE未致敏24 h组、TCE未致敏72 h 2 结果
组。

试验前通过预实验确定TCE诱导及激发浓度，并 2.1 皮肤反应视觉评分结果
在实验前24 h，用小型电动剃刀剔去豚鼠颈背部被在本次致敏试验中，空白对照组和溶剂对照组均
３４５
未见红斑或水肿；TCE处理组26只豚鼠有17只致敏， 2.2 血清中肝功能的测定
全血生化分析结果见表2。

溶剂对照组肝功能各指
致敏率65.38%。

见表1。

标与空白组相比，差异均无统计学意义 (P > 0.05)； TCE致敏组ALT水平与溶剂对照组相比升高，差异有统计学意义 (P < 0.05)；而TCE未致敏组ALT水平与溶剂对照组相比差异无统计学意义 (P > 0.05)； T CE致敏72 h 组ALT和AST水平比TCE致敏24 h 组和TCE未致敏72 h 组升
高，差异有统计学意义 (P < 0.05)； T CE致敏72 h 组ALB水平比溶剂对照组和TCE未致敏72 h 组降低 (P < 0.05)。

表 2 不同组别豚鼠肝功能结果 ()Table 2 Liver function in different groups of guinea pig -x
±s -globulin. Compared with solvent group， a：P <0.05； compared with the corresponding time point of TCE non-sensitized group， b：P <0.05；compared with TCE sensitized-24 h group， c ：P <0.05.
激发后24 h 水肿程度轻微，而末次激发后72 h 动物能见2.3 肝脏组织病理学改变
各实验组的每只动物均进行病理学检查。

豚鼠肝到较多大量肝细胞水肿，并有胞核破裂消失。

见图1。

细胞在空白对照组排列整齐，胞质均匀，胞核大而 2.4 肝脏组织超微结构改变
圆，核仁明显，核膜清晰；溶剂对照组未见明显异空白对照组和溶剂对照组肝脏超微结构未见明显常；TCE未致敏组部分动物能见到肝细胞水肿；异常；TCE未致敏24 h组可见少量线粒体肿胀、变TCE致敏组几乎所有动物均有肝细胞的水肿，但末次
性，核染色质相对减少，分布不均；TCE致敏24 h 组
B C
A D E F
图 1 豚鼠肝组织病理学改变 (HE，×200) A： 空白对照组； B： 溶剂对照组； C： TCE未致敏24 h组； D： TCE致敏24 h组； E： TCE未致敏72 h组； F： TCE致敏72 h组 (箭头示肝细胞水肿，胞核破裂消失).
Figure 1 Histopathological changes of guinea pig (stained by HE , ×200).
A : control group ;
B : solvent control group ;
C : TCE unsensitized 24 h group ;
D : TC
E sensitized 24 h group ; E : TCE unsensitized 72 h group ;
F : TCE sensitized 72 h group (arrow showed edema in liver cells and nucleus away rupture).
表 1 皮肤反应评分结果
.
３４６
可见线粒体数量减少，部分线粒体空泡、变性，粗面数量明显减少、多数线粒体肿胀变性，粗面内质网断内质网断裂，糖原颗粒减少，核染色质相对减少；裂明显、糖原颗粒明显减少，核染色质明显减少，可TCE未致敏72 h组可见少量线粒体空泡、变性，部分见显著的分布不均。

TCE致敏72 h组肝脏损害比24 h组线粒体结构不清，粗面内质网断裂、扩张，核染色质更严重。

见图2。

减少，分布不均；TCE致敏72 h 组肝脏细胞中线粒体
A
B C
D E F
图 2 豚鼠肝组织电镜图片 (×6 000). A： 空白对照组； B： 溶剂对照组； C： TCE未致敏24 h组； D： TCE致敏24 h组 (线粒体空
箭头示
泡、变性，核染色质相对减少)； E： TCE未致敏72 h组； F： TCE致敏72 h组 (箭头示线粒体肿胀变性，核染色质减少明显).
Figure 2 Electron micrograph of guinea pig’s liver (×6 000). A: control group; B: solvent control group; C: TCE unsensitized 24 h group; D: TCE sensitized 24 h group(arrow showed mitochondrial vacuoles, degeneration, nuclear chromatin reduced); E: TCE unsensitized 72 h group; F: TCE sensitized 72 h group(arrow showed mitochondrial swelling and degeneration, nuclear chromatin reduced significantly).
敏豚鼠肝功能指标的变化和肝脏的超微结构改变，以3 讨论
期为DMLT患者伴肝损伤的机制研究提供理论依据。

TCE的职业暴露主要通过呼吸道吸入和皮肤的直
[6]
Tang等的研究发现TCE可以引起急性中毒性肝损接接触。

TCE药疹样皮炎(DMLT)患者，临床表现主要
[3]伤和免疫介导的肝损伤，皮炎的发生和肝损伤有一定为严重的皮肤损害，并伴有表皮淋巴结肿大，甚至
[7]
[4]的相关性。

张雪涛等对3例DMLT患者分析时发现3例出现黏膜水肿、渗出等。

高浓度TCE暴露可对人体造
[5]患者均有肝功能损害，但严重程度和表现形式不一。

成肝脏等器官的损害。

同时近年来根据对DMLT病例
[8]
而王慧等在对3例DMLT患者的治疗中发现3例患者的的资料调查后发现，DMLT病人常常伴有严重肝损
肝脏损伤均较严重。

本实验肝功能相关生化指标检测伤，而肝损伤是引起多脏器衰竭导致死亡的主要原
显示：TCE致敏组转氨酶ALT，AST明显升高(P<0.05)， 因，因此由TCE致敏引起的肝损伤引起了人们的高度
而且72 h组比24 h组升高更明显(P<0.05)； T CE致敏72 重视。

但到目前为止，尚无关于DMLT肝损害超微结
构改变的相关报道。

基于此，本研究通过整体动物实h组豚鼠白蛋白(ALB)水平降低(P<0.05)。

转氨酶是反映验，采用豚鼠最大值试验方法建立动物模型，检测致肝细胞损伤的指标，ALB水平则代表肝脏的合成功
３４７
.
[2] S anz P， N ogué S， V ilchez D， e t a l. M yoclonic e ncephalopathy 能。

这说明TCE致敏组除了皮肤的炎症损伤外，还伴
after e xposure t o t richloroethylene[J]. I ndustrial H ealth， 2008， 有肝细胞的损伤。

病理检查和电镜结果均显示在
46 (6)：635-637.
TCE致敏组，肝脏细胞超微结构发生损害，且在72 h组
[3] X u X， Y ang R， W u N， e t a l. S evere h ypersensitivity d ermatitis 的肝脏损害比24 h组更严重，说明TCE致敏豚鼠肝脏组
and liver dysfunction induced by occupational exposure to 织发生了病理结构的损害。

肝脏超微结构的变化趋势
trichloroethylene[J]. I nd H ealth，2009， 47 (2)：107-112.
和血清中肝功能的变化趋势基本一致。

根据实验结果
[4] 郑玉新，戴宇飞. 三氯乙烯药疹样皮炎研究进展[J]. 中国职我们推测，在皮肤致敏反应阴性的豚鼠体内也有肝脏业医学，2006，33 (5)：388-389.
的损伤；TCE致敏组豚鼠体内发生了肝脏功能障碍和[5] C hiu W A， C aldwell J C， K eshava N， e t a l. K ey s cientific 超微结构的破坏，肝脏的损伤在末次激发后随着时间issues in the health risk assessment of trichloroethylene[J]. 的延长是逐步加重的。

Environ H ealth P erspect，2006，114 (9)： 1445–1449.
本研究结果显示，TCE致敏组豚鼠肝脏的肝功能[6] T ang Xiaojiang， Que Bingling， Song Xiangrong， et al. 异常，超微结构破坏，且损伤的程度是随着时间的延Characterization of liver injury associated with hypersensitive 长逐步加重。

在TCE致敏的豚鼠体内肝脏损伤的具体skin reactions induced by trichloroethylene in the guinea pig 机制，还需要在以后的实验中做进一步的研究。

maximization test[J]. J Occup Health， 2008， 50 (2)：114-
121.
[7] 张雪涛，倪为民，冯玉妹，等. 职业性三氯乙烯药疹样皮参考文献
炎3例临床报告[J]. 中国职业医学，2008，35 (6)：494-495.
[1] M ichihiro K，Hailan W，Tamie N，et a l. T richloroethylene
[8] 王慧，周琳. 三氯乙烯致过敏性皮炎及多脏器损害3例
causes g eneralized h yperesensitivity s kin d isorders c omplicated
[J]. 现代中西医结合杂志，2009，18 (19)：2297-2298.
by h epatitis[J]. J O ccup H ealth ，2008，50 (4)：328-338.
３４８。