大蒜素对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及机制研究

关ꎬ而Ｇ试验㊁ＧＭ试验临界值尚未达到统一ꎬ所以本研究先通过ＲＯＣ曲线分析Ｇ试验㊁ＧＭ试验诊断临界值ꎬ结果发现ꎬ当Ｇ试验临界值为１４７.３７ｐｇ/ｍＬ或ＧＭ试验临界值为０.８８ｕｇ/Ｌ时ꎬＲＯＣ曲线下面积最大ꎬ诊断准确性最高ꎮ分别以１４７.３７ｐｇ/ｍＬ㊁０.８８ｕｇ/Ｌ为临界值ꎬＧ试验和ＧＭ试验单独诊断恶性血液病伴ＩＦＩ的敏感性分别为８８.００％和６８.００％ꎬ特异性分别为７１.
８８％和７０.３１％ꎬ两者联合诊断虽然特异性有所降低ꎬ但诊断敏感性㊁阴性预测值均可达到１００％ꎬ可有效避免漏诊ꎬ且联合诊断为阴性者ꎬ均可排除ＩＦＩꎬ减少过度使用抗真菌药物ꎬ与王霞[１２]等研究结果相似ꎮ
另外ꎬ本研究发现ꎬ与临床诊断相比ꎬＧ试验㊁ＧＭ试验及联合检测均能有效缩短ＩＦＩ诊断时间ꎬ为临床治疗争取到宝贵时间ꎬ减少因诊断时间过长所致的治疗延误ꎮ总而言之ꎬＧ试验和ＧＭ试验检测原理㊁物质代谢等存在差异ꎬ两者不能相互取代ꎬＧ试验联合ＧＭ试验检测能有效缩短诊断等待时间ꎬ避免患者漏诊ꎬ做到早发现㊁早治疗ꎬ促进患者早期康复ꎮ
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ʌ文章编号ɔ１００６－６２３３(２０２０)０６－０９５４－０６
大蒜素对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及机制研究
熊㊀文１ꎬ㊀魏㊀文１ꎬ㊀笪玉荣２
(１.湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院ꎬ㊀湖北㊀恩施㊀４４５０００
２.江汉大学医学院ꎬ㊀湖北㊀武汉㊀４３００５６)ʌ摘㊀要ɔ目的:探讨大蒜素对大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用及机制ꎮ方法:体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(ＶＳＭＣｓ)ꎬ使用２０ｎｇ/ｍＬ的血小板衍生生长因子ＢＢ(ＰＤＧＦ－ＢＢ)诱导ＶＳＭＣｓ增殖ꎮ将实验分４组:对照组(Ａ组)㊁ＰＤＧＦ－ＢＢ刺激组(Ｂ组)㊁ＰＤＧＦ－ＢＢ＋大蒜素处理组(Ｃ组)㊁ＰＤＧＦ－ＢＢ＋大蒜素＋脂多糖处理组(Ｄ组)ꎮ使用ＣＣＫ－８实验及流式细胞周期检测实验检测各组细胞增殖情况ꎮ蛋白免疫印迹法(ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ)检测各组细胞中总的核转录因子κＢｐ６５(ＮＦ－κＢｐ６５)及磷酸化ＮＦ
４５９ ʌ基金项目ɔ国家自然科学基金ꎬ(编号:８１２７０１８４)ʌ通讯作者ɔ魏㊀文
－κＢｐ６５(Ｐ－ｐ６５)蛋白表达水平ꎮ各组细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α(ＴＮＦ－α)㊁白细胞介素１β(ＩＬ－１β)含量采用ＥＬＩＳＡ检测ꎮ结果:细胞增殖实验检测结果显示ꎬ与Ａ组比较ꎬＢ组ＶＳＭＣｓ增殖活性显著增强ꎻ与Ｂ组比较Ｃ组ＶＳＭＣｓ增殖活性明显受到抑制ꎻ而与Ｃ组比较ꎬＤ组ＶＳＭＣｓ增殖活性增强(Ｐ均<０.０５)ꎮＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ结果表明ꎬ与Ａ组比较ꎬＢ组磷酸化ｐ６５与总的ｐ６５比值(Ｐ－ｐ６５/ｐ６５)提高２.７９倍(Ｐ<０.０５)ꎻ而与Ｂ组比较ꎬＣ组Ｐ－ｐ６５/ｐ６５显著降低近５８.０％(Ｐ<０.０５)ꎮ与Ｃ组比较ꎬＤ组Ｐ－ｐ６５/ｐ６５增加６４.８％(Ｐ<０.０５)ꎮ另外ꎬ各组间总的ＮＦ－κＢｐ６５水平未见统计学差异(Ｐ>０.０５)ꎮＥＬＩＳＡ检测结果表明ꎬ与Ａ组比较ꎬＢ组ＴＮＦ－α㊁ＩＬ－１β含量分别增加１.８０倍和２.７５倍ꎻ与Ｂ组比较ꎬＣ组ＴＮＦ－α㊁ＩＬ－１β含量分别降低４４.４％和４５.８％ꎻ而与Ｃ组比较ꎬＤ组ＴＮＦ－α㊁ＩＬ－１β含量分别增加２８.１％和３９.９％(Ｐ均<０.０５)ꎮ结论:大蒜素对大鼠ＶＳＭＣｓ增殖具有显著的抑制作用ꎬ其机制可能与抑制ＮＦ－κＢ信号通路介导的炎症反应有关ꎮ
ʌ关键词ɔ㊀大蒜素ꎻ㊀血管平滑肌细胞ꎻ㊀增㊀殖ꎻ㊀炎㊀症
ʌ文献标识码ɔ㊀Ａ㊀㊀㊀㊀㊀ʌｄｏｉɔ１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００６－６２３３.２０２０.０６.０１６
ＡＳｔｕｄｙｏｆｔｈｅＲｏｌｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＡｌｌｉｃｉｎｏｎｔｈｅ
ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＲａｔＶａｓｃｕｌａｒＳｍｏｏｔｈＭｕｓｃｌｅＣｅｌｌｓ
ＸＩＯＮＧＷｅｎꎬＷＥＩＷｅｎꎬｅｔａｌ
(ＴｈｅＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＥｎｓｈｉꎬＨｕｂｅｉＥｎｓｈｉ４４５０００ꎬＣｈｉｎａ)
ʌＡｂｓｔｒａｃｔɔＯｂｊｅｃｔｉｖｅｓ:Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｌｌｉｃｉｎｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｒａｔｖａｓ￣ｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ:Ｒａｔｔｈｏｒａｃｉｃａｏｒｔｉｃｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ(ＶＳＭＣｓ)ｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｖｉｔｒｏꎬａｎｄ２０ｎｇ/ｍＬｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒＢＢ(ＰＤＧＦ－ＢＢ)ｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｎｄｕｃｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＶＳＭＣｓ.Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｕｂｊｅｃｔｗａｓｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ４ｇｒｏｕｐｓ:ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ(ｇｒｏｕｐＡ)ꎬＰＤＧＦ－ＢＢｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ(ｇｒｏｕｐＢ)ꎬＰＤＧＦ－ＢＢ＋ａｌｌｉｃｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ(ｇｒｏｕｐＣ)ꎬＰＤＧＦ－ＢＢ＋ａｌｌｉｃｉｎ＋ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ(ｇｒｏｕｐＤ).ＴｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＣＣＫ－８ａｓｓａｙａｎｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ.ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｔｏｔａｌｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢｐ６５(ＮＦ－κＢｐ６５)ａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄＮＦ－κＢｐ６５(Ｐ－ｐ６５)ｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ.Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ－α(ＴＮＦ－α)ａｎｄｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１β(ＩＬ－１β)ｉｎｔｈｅｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥＬＩＳＡ.Ｒｅｓｕｌｔｓ:ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｇｒｏｕｐＡꎬｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＶＳＭＣｓｉｎｇｒｏｕｐＢｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｅｎｈａｎｃｅｄ.ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｇｒｏｕｐＢꎬｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＶＳＭＣｓｉｎｇｒｏｕｐＣｗａｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄ.ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｇｒｏｕｐＣꎬｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＶＳＭＣｓｉｎｇｒｏｕｐＤｗａｓｅｎｈａｎｃｅｄ(Ｐ<０.０５).ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｇｒｏｕｐＡꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＰ－ｐ６５ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｇｒｏｕｐＢｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ.ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｇｒｏｕｐＢꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＰ－ｐ６５ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｇｒｏｕｐＣｗａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄ.ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｇｒｏｕｐＣꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＰ－ｐ６５ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｇｒｏｕｐＤｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｇｒｏｕｐＣ(Ｐ<０.０５).ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬｔｈｅｔｏｔａｌｏｆＮＦ－κＢｐ６５ｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐｓｈｏｗｅｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ(Ｐ>０.０５).ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＥＬＩＳＡｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｇｒｏｕｐＡꎬｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＴＮＦ－αａｎｄＩＬ－１βｉｎｇｒｏｕｐＢｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ.ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｇｒｏｕｐＢꎬｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＴＮＦ－αａｎｄＩＬ－１βｉｎｇｒｏｕｐＣｗｅｒｅｌｏｗｅｒ.ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｇｒｏｕｐＣꎬｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＴＮＦ－αａｎｄＩＬ－１βｉｎｇｒｏｕｐＤｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ(Ｐ<０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ:ＡｌｌｉｃｉｎｃａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＶＳＭＣｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＰＤＧＦ－ＢＢꎬａｎｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｓｒｅ￣ｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＮＦ－κＢｐａｔｈｗａｙａｎｄｔｈｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅ.
ʌＫｅｙｗｏｒｄｓɔ㊀Ａｌｌｉｃｉｎꎻ㊀Ｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌꎻ㊀Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎꎻ㊀Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ
㊀㊀随着我国经济的快速发展及国民生活方式的深刻变化ꎬ我国心脑血管疾病的发病人数也持续增加[１]ꎮ虽然近年来血管介入技术在心脑血管疾病治疗中的普及挽救了大量患者的生命ꎬ但介入术后的血管再狭窄问题也一直影响着患者术后疗效[２]ꎮ众所周知ꎬ血管平滑肌细胞的过度增殖以及局部炎症反应的激活是导致血管再狭窄的重要原因ꎮ大蒜素是从大蒜中提取的活性成分ꎬ具有多种生物学活性ꎮ研究发现大蒜素可
５５９
抑制多种肿瘤细胞的增殖ꎬ且发挥作用与其影响炎症反应密切相关[３]ꎮ同时大蒜素对血管平滑肌细胞钙电流具有一定的影响ꎬ但目前为止关于大蒜素对血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制研究却少有报道ꎮ因此ꎬ本研究通过体外培养ＶＳＭＣｓꎬ并使用血小板衍生生长因子ＢＢ(ＰＤＧＦ－ＢＢ)刺激ＶＳＭＣｓ增殖ꎬ观察了大蒜素对ＶＳＭＣｓ增殖的作用以及对ＮＦ－κＢ信号通路介导的炎症反应的影响ꎬ从而为血管再狭窄治疗寻找潜在的药物ꎮ
１㊀材料与方法
１.１㊀材料:ＳＤ雄性大鼠(１２０~１５０ｇ)ꎬ购自北京维通利华实验动物技术有限公司ꎮ大蒜素购自美国Ｓｉｇｍａ生物公司ꎻ血小板衍生生长因子ＢＢ(ＰＤＧＦ－ＢＢ)购自美国Ｒ＆Ｄ公司ꎻＤＭＥＭ/Ｆ１２培养基及１ˑ磷酸盐缓冲液均购自美国ＨｙＣｌｏｎｅ公司ꎻ胎牛血清(ＦＢＳ)购自杭州四季青公司ꎻＣＣＫ－８细胞毒性及增殖检测试剂盒(ＣＣＫ－８)购自日本同仁化学研究所ꎻＢＣＡ蛋白浓度检测试剂盒㊁脂多糖(ＬＰＳ)㊁辣根过氧化物酶(ＨＲＰ)抗体㊁甘油醛－３－磷酸脱氢酶(ＧＡＰＤＨ)均购自上海碧云天生物公司ꎻ核转录因子κＢｐ６５(ＮＦ－κＢｐ６５)及磷酸化ＮＦ－κＢｐ６５(Ｐ－ｐ６５)一抗均购自美国ＣＳＴ公司ꎻ肿瘤坏死因子α(ＴＮＦ－α)㊁白细胞介素１β(ＩＬ－１β)ＥＬＩＳＡ试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司ꎮ
１.２㊀方㊀法
１.２.１㊀大鼠胸主动脉平滑肌细胞的分离培养和鉴定:根据文献[４]中所述ꎬ获取并培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞ꎬ用大鼠α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ抗体进行免疫荧光染色鉴定ＶＳＭＣｓꎮ将细胞纯度达到９５％以上的第３~５代血管平滑肌细胞用于后续实验ꎮ
１.２.２㊀实验分组:将实验共分为４组:对照组(Ａ组)㊁ＰＤＧＦ－ＢＢ刺激组(Ｂ组)㊁ＰＤＧＦ－ＢＢ＋大蒜素处理组(Ｃ组)㊁ＰＤＧＦ－ＢＢ＋大蒜素＋脂多糖处理组(Ｄ组)ꎮ１.２.３㊀ＣＣＫ－８实验:根据文献[５]中所述ꎬ步骤如下:①细胞活性检测:将血管平滑肌细胞从培养皿上消化下来后ꎬ以２.０ˑ１０４个/孔接种在９６孔板中ꎮ培养２４ｈ后待细胞生长融合至底壁８０％时ꎬ将培养基更换为无血清培养基进行饥饿处理２４ｈꎬ然后再将细胞与含不同浓度(４ꎬ８ꎬ１６ꎬ３２ꎬ６４和１２８μｍｏＬ/Ｌ)的大蒜素素或０.１％的ＤＭＳＯ的培养基共孵育２４ｈꎬ向每孔加入１０μＬＣＣＫ－８试剂继续培养２ｈ后ꎬ在酶标仪上(４５０ｎｍ)测各孔的光密度(ＯＤ)值ꎮ②细胞增殖检测:将４组细胞按２.０ˑ１０４个/孔接种于９６孔板中ꎬ待血管平滑肌细胞融合至培养板底壁５０％~６０％ꎬ将培养基更换为无血清培养基饥饿处理２４ｈ后ꎬ然后向Ａ组中加入含１％ＦＢＳ的培养基ꎬ其余３组在加入１％ＦＢＳ的基础上ꎬ分别向Ｂ组中加入ＰＤＦ－ＢＢ刺激㊁向Ｃ组中加入ＰＤＧＦ－ＢＢ和大蒜素刺激㊁向Ｄ组中加入ＰＤＧＦ－ＢＢ和大蒜素及脂多糖刺激ꎬ２４ｈ后向每孔加入１０ｕＬＣＣＫ－８试剂继续培养２ｈ后ꎬ在酶标仪上(４５０ｎｍ)测各孔的ＯＤ值ꎮ每组设６个复孔ꎮ
１.２.４㊀流式细胞仪检测细胞周期:将细胞接种于６ｃｍ培养皿中ꎬ待细胞融合至６０％左右时ꎬ饥饿处理２４ｈꎮ后将各组培养基更换为含ＰＤＧＦ－ＢＢ和/或相应浓度大蒜素及脂多糖的１％ＦＢＳ的培养基ꎬ继续培养２４ｈꎮ接着用胰酶将细胞消化下来并在水平离心机中以１０００转/ｍｉｎ的转速离心ꎬ然后使用预冷的ＰＢＳ将细胞洗涤２次后ꎬ在涡旋仪上边涡旋边加入预冷的７０％的乙醇固定细胞ꎬ然后放置４ħ过夜ꎮ取出细胞离心并用ＰＢＳ洗涤细胞２次ꎬ然后加入０.４ｍＬＰＩ稀释液(含５０ｍｇ/Ｌ的ＰＩ和１００ｍｇ/Ｌ的ＲＮａｓｅＡ)室温避光孵育３０ｍｉｎꎬ然后使用流式细胞仪(ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎꎬＵＳＡ)检测各组细胞周期分布情况ꎬ实验重复３次ꎮ计算Ｓ期分数和细胞增殖指数ꎮＳ期分数(ＳＰＦ)＝Ｓ/ (Ｇ０/Ｇ１＋Ｓ＋Ｇ２/Ｍ)ˑ１００％ꎮ细胞增殖指数(ＰＩ)＝(Ｓ＋Ｇ２/Ｍ)/(Ｇ０/Ｇ１＋Ｓ＋Ｇ２/Ｍ)ˑ１００％ꎮ
１.２.５㊀蛋白免疫印迹法(Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ)检测蛋白表达:各组细胞按条件培养完成后ꎬ弃去培养上清液后ꎬ使用预冷的ＰＢＳ清洗３遍ꎬ然后使用预冷细胞裂解液裂解细胞以获得蛋白ꎬ然后通过ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒根据说明书操作测定各组蛋白浓度ꎬ然后向各组蛋白中加入上样缓冲液煮沸后备用ꎮ然后将蛋白加入１０％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳ꎮ电泳完成后进行电转并进行封闭ꎮ然后根据指示条带将目的条带裁剪后分别与对应的一抗(ＮＦ－κＢｐ６５㊁磷酸化ＮＦ－κＢｐ６５㊁ＧＡＰＤＨ)于４ħ水平摇床中孵育１８ｈ以上ꎮ然后将不同分子蛋白条带取出后放入ＰＢＳＴ中在水平摇床上洗涤３次ꎬ每次５ｍｉｎꎬ然后将条带与ＨＲＰ二抗室温孵育１~２ｈꎮ取出条带放入ＰＢＳＴ中在水平摇床上洗涤３次ꎬ每次５ｍｉｎꎬ然后将蛋白面朝上放入化学发光成像系统ꎬ打开ＩｍａｇｅＬａｂ成像系统(ＢＩＯ－ＲＡＤꎬ美国)拍取图像ꎬ通过软件测定各种目的蛋白条带灰度值及对应的内参ＧＡＰＤＨ的灰度值ꎬ然后进行半定量分析ꎮ１.２.６㊀ＥＬＩＳＡ法测定培养上清液中ＴＮＦ－α㊁ＩＬ－１β含量:各组细胞经ＰＤＧＦ－ＢＢ和/或大蒜素及脂多糖处理２４ｈ后ꎬ收集各组细胞培养液后离心去除细胞碎片ꎬ按照ＥＬＩＳＡ试剂盒说明书操作ꎬ计算出样品中对应的浓度ꎮ实验重复３次ꎮ
６５９
１.３㊀统计学处理:结果以均数ʃ标准差( ｘʃｓ)或率(％)表示ꎬ多组间比较采用方差分析ꎬ两组间比较用ｔ检验ꎮＰ值小于０.０５ꎬ表示有统计学差异ꎮ以ＳＰＳＳ２２.０统计软件包进行统计学分析ꎮ２㊀结㊀果
２.１㊀大蒜素对ＶＳＭＣｓ活性的影响:ＣＣＫ－８结果(图１)显示ꎬ大蒜素浓度高于或等于６４μｍｏＬ/Ｌ时ꎬ大蒜素可显著抑制ＶＳＭＣｓ活性(Ｐ<０.０５)ꎻ而当大蒜素浓度低于６４μｍｏＬ/Ｌ后ꎬ大蒜素对ＶＳＭＣｓ活性无明显影响(Ｐ>０.０５)ꎬ故本实验选取的大蒜素浓度为３２μｍｏＬ/Ｌꎮ
表１㊀各组血管平滑肌细胞Ｓ期分数和细胞增殖指数( ｘʃｓ
ꎬ％)组别Ａ组Ｂ组Ｃ组Ｄ组Ｓ期分数(％)１９.３２ʃ１.２５４５.７６ʃ２.８６∗２５.５７ʃ２.６２＃４０.０７ʃ２.０３＆细胞增殖指数(％)
２７.３５ʃ２.０１
５４.０６ʃ２.３４∗
３０.１４ʃ３.１５＃
４５.８１ʃ２.８８＆
㊀㊀注:与Ａ组比较ꎬ∗Ｐ<０.０１ꎻ与Ｂ组比较ꎬ＃Ｐ<０.０１ꎻ与Ｃ组比较ꎬ＆Ｐ<０.０５ꎻｎ＝
３
图１㊀大蒜素对大鼠血管平滑肌细胞活性的影响
注:与ＤＭＳＯ组比较ꎬ∗∗Ｐ<０.０１ꎻｎ＝６
２.２㊀大蒜素对ＶＳＭＣｓ增殖的影响:ＣＣＫ－８实验检测各组细胞增殖情况(图２)显示ꎬ与Ａ组比较ꎬＢ组ＶＳＭＣｓ增殖活性增强１.２５倍ꎻ与Ｂ组比较Ｃ组ＶＳＭＣｓ
增殖活性降低４７.７５％ꎻ而与Ｃ组比较ꎬＤ组ＶＳＭＣｓ增殖活性增强３８.０１％(Ｐ均<０.０５
)ꎮ
图２㊀大蒜素对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响
注:与Ａ组比较ꎬ∗∗Ｐ<０.０１ꎻ与Ｂ组比较ꎬ＃＃Ｐ<０.０１ꎻ与Ｃ组比较ꎬ＆＆Ｐ<０.０１ꎻｎ＝６
流式细胞周期检测结果如表１所示ꎬ与Ａ组比较ꎬ
Ｂ组细胞经ＰＤＧＦ－ＢＢ刺激后Ｓ期分数和细胞增殖指
数分别升高１.３７倍和０.９８倍(Ｐ均<０.０５)ꎬ提示ＰＤＧＦ－ＢＢ刺激后细胞周期进展加快ꎬ细胞增殖能力增强ꎮ
然而与Ｂ组比较ꎬＣ组加入大蒜素处理后ꎬＳ期分数和细胞增殖指数分别降低４４.１％和４４.２％(Ｐ均<０.０５)ꎬ表明细胞周期阻滞ꎬ细胞增殖能力减弱ꎮ而与Ｃ组比较ꎬＤ组加入脂多糖刺激后ꎬＳ期分数和细胞增殖指数分别升高５６.７％和５２.０％(Ｐ均<０.０５)ꎬ细胞周期进展
较Ｃ组加快ꎬ细胞增殖活性增强ꎮ
２.３㊀大蒜素抑制ＶＳＭＣｓ中Ｐ－ｐ６５表达:Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示(图３)ꎬ与Ａ组比较ꎬＢ组磷酸化ｐ６５与总的ｐ６５比值(Ｐ－ｐ６５/ｐ６５)提高２.７９倍(Ｐ<０.０５)ꎻ而与Ｂ
组比较ꎬＣ组Ｐ－ｐ６５/ｐ６５显著降低近５８.０％(Ｐ<０.０５)ꎮ与Ｃ组比较ꎬＤ组Ｐ－ｐ６５/ｐ６５增加６４.８％(Ｐ<０.０５)ꎮ另外ꎬ各组间总的ＮＦ－κＢｐ６５水平未见统计学差异(Ｐ>０.０５)ꎮ
图３㊀大蒜素对血管平滑肌细胞内核转录因子κＢｐ６５的影响
注:与Ａ组比较ꎬ∗∗Ｐ<０.０１ꎻ与Ｂ组比较ꎬ＃＃Ｐ<０.０１ꎻ与Ｃ
组比较ꎬ＆Ｐ<０.０５ꎻｎ＝３
２.４㊀大蒜素抑制ＶＳＭＣｓ中ＴＮＦ－α㊁ＩＬ－１β表达ＥＬＩＳＡ结果(图４)显示ꎬ与Ａ组比较ꎬＰＤＧＦ－ＢＢ刺激后培养上清液中ＴＮＦ－α㊁ＩＬ－１β浓度分别增加１.８０倍和２.７５倍(Ｐ均<０.０５)ꎻ而与Ｂ组比较ꎬＣ组培养上清液中ＴＮＦ－α㊁ＩＬ－１β浓度分别降低４４.４％和４５.８％(Ｐ均<０.
０５)ꎮ另外ꎬ与Ｃ组比较ꎬＤ组培养上清液中ＴＮＦ－α㊁ＩＬ
７５９
－１β浓度分别增加２８.１％和３９.９％(Ｐ均<０.０５)ꎮ以上结果提示ꎬ大蒜素可抑制ＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的炎症相关因子的表达
ꎮ
图４㊀大蒜素对血管平滑肌细胞炎症因子ＴＮＦ－α㊁ＩＬ－１β表达的影响
注:与Ａ组比较ꎬ∗∗Ｐ<０.０１ꎻ与Ｂ组比较ꎬ＃Ｐ<０.０５ꎬ＃＃Ｐ<０.０１ꎻ与Ｃ组比较ꎬ＆Ｐ<０.０５ꎻｎ＝３
３㊀讨㊀论
ＶＳＭＣｓ过度增殖是引起血管再狭窄发生的重要原
因之一ꎮ基于血管成形术以及支架植入术在内的介入操作及原发疾病引起的血管内膜损伤ꎬ可引起血液中白细胞㊁血小板及脂质颗粒等聚集并产生炎症反应ꎻ与此同时ꎬ聚集的血小板㊁炎症细胞等分泌细胞生长因子和炎症因子等介质ꎬ而这些介质可诱导ＶＳＭＣｓ由静止的收缩型向活跃的合成型转变ꎬ从而引起血管内膜过度增殖并迁移至内膜ꎬ最终导致血管狭窄的发生ꎮ由此可见ꎬ对血管内膜过度增殖及炎症反应进行干预ꎬ可有效减少血管再狭窄的发生ꎮ
大蒜素是大蒜的主要活性物质ꎬ具有抗氧化ꎬ抗肿瘤及防治心肌纤维化等多种功效ꎮ在阿霉素诱导的大鼠心脏毒性模型中ꎬ大蒜素可抑制ＮＦ－κＢ蛋白表达或核转位ꎬ并降低大鼠血清中炎症因子(包括ＩＬ－１β和ＴＮＦ－α)水平显示出抗炎作用[６]ꎮ研究表明ꎬ包括ＩＬ－１β和ＴＮＦ－α等在内的炎症因子对ＶＳＭＣｓ增殖具有促进作用ꎻ抑制ＮＦ－κＢ信号通路激活ꎬ可通过降低下游炎症因子的表达而对血管平滑肌细胞增殖起到抑制作用ꎬ从而减少血管损伤后新生内膜的形成[７]ꎮ最新研究也显示ꎬＬＰＳ作为ＮＦ－κＢ信号通路的一种激活剂ꎬ它可通过诱导ＮＦ－κＢ信号通路的激活对血管平滑肌细胞增殖和迁移起到促进作用
[８]
ꎮ与之前研究相
似ꎬ本研究中发现大蒜素可显著抑制ＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＶＳＭＣｓ增殖ꎮ进一步机制研究发现大蒜素可明显抑制ＶＳＭＣｓ内ＮＦ－κＢｐ６５蛋白的磷酸化ꎬ以及降低了ＮＦ－κＢ信号通路下游的包括ＴＮＦ－α㊁ＩＬ－１β在内的炎症因子的水平ꎻ而加用ＮＦ－κＢ信号通路激活剂ＬＰＳ刺激后ꎬ可削弱大蒜素抑制ＶＳＭＣｓ增殖的能力ꎬ同时ＮＦ－κＢｐ６５蛋白的磷酸化水平㊁ＩＬ－１β㊁ＴＮＦ－α浓度均有所上升ꎮ
ＰＤＧＦ－ＢＢ是一种重要的促有丝分裂因子ꎬ可以通
过激活细胞内多种信号通路促进细胞分裂增殖ꎮ有研究显示ꎬＰＤＧＦ－ＢＢ在血管损伤后的新生血管内膜增生中具有促进作用ꎬ其可诱导ＶＳＭＣｓ增殖并向内膜迁移[９]ꎮ因此ꎬＰＤＧＦ－ＢＢ常被用来作为细胞增殖模型的诱导剂使用ꎮ我们的数据也显示ꎬ体外培养的ＶＭＳＣｓ经ＰＤＧＦ－ＢＢ刺激后ꎬ其增殖能力显著增强ꎮＬＰＳ可作为ＮＦ－κＢ信号通路的激活剂ꎬ其可通过增强ＮＦ－κＢ信号通路的激活ꎬ增强炎症因子表达ꎬ本实验显示其可
削弱大蒜素抑制ＶＳＭＣｓ增殖的能力ꎬ这为进一步确定大蒜素发挥作用的机制与其抑制ＮＦ－κＢ信号通路之间的关系提供了可靠的依据ꎮ
总之ꎬ我们的实验结果表明ꎬ大蒜素可显著抑制ＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的血管平滑肌细胞的增殖ꎬ而发挥作用的机制与抑制ＮＦ－κＢ信号通路激活及减弱炎症反应有关ꎮ
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ʌ文章编号ɔ１００６－６２３３(２０２０)０６－０９５９－０５
肝脏瞬时弹性超声成像对ＣＨＢ合并酒精性肝病患者
肝纤维化分期的诊断价值分析
刘品兰１ꎬ㊀姜琳琳２
(１.辽宁省丹东市中心医院超声科ꎬ㊀辽宁㊀丹东㊀１１８０００
２.沈阳医学院附属中心医院电诊科ꎬ㊀辽宁㊀沈阳㊀１１００００)
ʌ摘㊀要ɔ目的:分析肝脏瞬时弹性超声成像对慢性乙型肝炎(ＣＨＢ)合并酒精性肝病患者肝纤维化分期的诊断价值ꎮ方法:采用回顾性研究ꎬ收集本院６７例ＣＨＢ合并酒精性肝病患者的临床资料ꎬ均行肝脏瞬时弹性超声成像检查和肝组织穿刺活检术ꎻ根据Ｉｓｈａｋ评分ꎬ进行肝纤维化分期ꎻ比较不同肝纤维化分期的患者基线资料㊁血生化指标及肝脏硬度值的差异ꎮ经Ｓｐｅａｒｍａｎ相关性分析肝脏硬度值与患者肝纤维化分期的关系ꎬ通过绘制受试者工作特征(ＲＯＣ)曲线以评价肝脏硬度值对肝纤维化的预测价值ꎬ并计算敏感度和特异度ꎮ结果:６７例患者中ꎬ肝纤维化分期０期８例ꎬ１期１５期ꎬ２期１７例ꎬ３期９例ꎬ４期８例ꎬ５期７例ꎬ６期３例ꎮ不同肝纤维化分期的患者年龄㊁白蛋白㊁总胆红素㊁丙氨酸氨基转移酶(ＡＬＴ)及凝血酶原活动度(ＰＴＡ)比较ꎬ差异均具有统计学意义(Ｐ<０.０５)ꎻ不同肝纤维化分期的患者性别㊁体质量指数及天门冬氨酸氨基转移酶(ＡＳＴ)比较ꎬ差异均无统计学意义(Ｐ>０.０５)ꎮ不同肝纤维化分期的患者肝脏硬度值比较ꎬ差异具有统计学意义(Ｐ<０.００１)ꎮ经Ｓｐｅａｒｍａｎ相关性分析显示ꎬ肝脏硬度值与患者肝纤维化分期存在正相关关系(Ｐ<０.００１)ꎮ肝脏硬度值的阈值为７.７５ｋＰａ时ꎬ其诊断ＣＨＢ合并酒精性肝病患者肝纤维化的敏感度和特异度分别为８９.８３％㊁７５.００％ꎬＲＯＣ曲线下面积为０.８４(Ｐ<０.００１)ꎮ结论:肝脏瞬时弹性超声成像对ＣＨＢ合并酒精性肝病患者肝纤维化程度具有较高的诊断价值ꎬ可用于早期评估肝纤维化分期ꎮ
ʌ关键词ɔ㊀肝脏瞬时弹性超声成像ꎻ㊀酒精性肝病ꎻ㊀慢性乙型肝炎ꎻ㊀肝纤维化
ʌ文献标识码ɔ㊀Ａ㊀㊀㊀㊀㊀ʌｄｏｉɔ１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００６－６２３３.２０２０.０６.０１７
ＡｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＶａｌｕｅｏｆＴｒａｎｓｉｅｎｔＥｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙｉｎｔｈｅＳｔａｇｉｎｇｏｆＬｉｖｅｒＦｉｂｒｏｓｉｓｉｎＣＨＢＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＡｌｃｏｈｏｌｉｃＬｉｖｅｒＤｉｓｅａｓｅ
ＬＩＵＰｉｎｌａｎꎬＪＩＡＮＧＬｉｎｌｉｎ
(ＤａｎｄｏｎｇＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌꎬＬｉａｏｎｉｎｇＤａｎｄｏｎｇ１１８０００ꎬＣｈｉｎａ)
ʌＡｂｓｔｒａｃｔɔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ:Ｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｖａｌｕｅｏｆｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙｉｎｔｈｅｓｔａｇｉｎｇｏｆｌｉｖ￣ｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｈｒｏｎｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ(ＣＨＢ)ａｎｄａｌｃｏｈｏｌｉｃｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ.Ｍｅｔｈｏｄｓ:Ａｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｓｔｕｄｙｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｔｏｃｏｌｌｅｃｔｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｄａｔａｏｆ６７ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＣＨＢａｎｄａｌｃｏｈｏｌｉｃｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅｉｎｏｕｒｈｏｓ￣ｐｉｔａｌ.Ａｌｌｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｂｙｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｌａｓｔｉｃｕｌｔｒａｓｏｕｎｄａｎｄｌｉｖｅｒｂｉｏｐｓｙ.ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＩｓｈａｋｓｃｏｒｅꎬｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓｗａｓｐｅｒｉｏｄｉｚｅｄ.Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｏｆｂａｓｅｌｉｎｅｄａｔａꎬｂｌｏｏｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｎｄｅｘｅｓａｎｄｌｉｖｅｒｈａｒｄｎｅｓｓｖａｌｕｅｓｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄ.ＴｈｒｏｕｇｈＳｐｅａｒｍａｎｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓꎬｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｌｉｖｅｒｈａｒｄｎｅｓｓａｎｄｔｈｅｓｔａｇｅｏｆｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓｗａｓａｎａｌｙｚｅｄ.Ｔｈｅｒｅｃｅｉｖｅｒｏｐｅｒａｔｉｎｇｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ(ＲＯＣ)ｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅｓｕｂｊｅｃｔｓｗａｓｐｌｏｔｔｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｖａｌｕｅｏｆｌｉｖｅｒｈａｒｄｎｅｓｓｏｎｌｉｖ￣ｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓꎬａｎｄｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄ.Ｒｅｓｕｌｔｓ:Ｏｆｔｈｅ６７ｐａｔｉｅｎｔｓꎬｔｈｅｒｅｗｅｒｅ８ｃａｓｅｓ
９５９ ʌ基金项目ɔ辽宁省自然科学基金项目ꎬ(编号:２０１７０４０２９)。