4第四章 单克隆抗体与基因工程抗体制备技术
主管检验技师考试临床免疫学和免疫检验讲义第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备
第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。
第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的原理是利用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测、筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。
将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。
杂交瘤技术是一项周期长和高度连续性的实验技术，涉及大量的细胞培养、免疫化学等方法。
具体包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化等。
一、杂交瘤技术（一）小鼠骨髓瘤细胞1.细胞株稳定，易于传代培养。
2.细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。
3.该细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷株。
4.目前最常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/O细胞株。
（二）免疫脾细胞免疫时选用与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠，鼠龄8～12周，体重约20g，雌雄均可，但必须分笼。
免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法。
如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫。
（三）细胞融合细胞融合是产生杂交瘤细胞的中心环节。
PEG（聚乙二醇）有助于细胞融合。
常用PEG分子量1000D、1500D或4000D。
（四）杂交瘤细胞的选择性培养将经过融合的细胞置于含有次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷的HAT培养基中。
1.脾细胞：在一般培养基中不能生长繁殖。
2.骨髓瘤细胞：采用的小鼠骨髓瘤细胞都是HGPRT或TK代谢缺陷型细胞，在HAT培养基中，不仅合成DNA的主要途径被氨基蝶呤阻断，又因缺乏HGPRT或TK而不能利用次黄嘌呤，虽有TK可利用胸腺嘧啶核苷，但终因缺乏嘌呤不能完整合成DNA，而使骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡。
单克隆抗体及基因工程抗体制备技术
子量1000D、1500D、4000DPEG作为细胞融合剂，浓 度在30%~50%之间。基本方法是将骨髓瘤细胞与脾细 胞按1：2~1:10比例混合，加入PEG，诱导俩种细胞融 合，时间控制在2分钟以内，在加入培养液缓慢稀释 PEG融合液至失去融合作用，融合细胞形成具有2个 或多个核的异核体，最终产生杂交细胞
antibody, MAb)
单克隆抗体优点：
• 高度纯一 • 高度专一
• 效价高
• 无交叉反应
应用：
• 成本低能大
量制备
疾病的论断和治疗(生物导弹)
生物大分子的鉴定、定位和分离纯化
细胞器的鉴定、定位和分离
特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离
动物免疫 BALB/c
X抗原
B淋巴细胞 瘤的突变株
培养上清中X抗体的检测 克隆化培养
细胞融合：
分泌抗体 短命 脾细胞 (B淋巴细胞)
长命 不分泌抗体
骨髓瘤细胞
分泌抗体 长命 杂交瘤细胞
Köhler和Milstein, 1975
1984年Nobel医学奖
4. 杂交瘤细胞的选择性培养：源自 肿瘤细胞合成DNA通常有俩 条途径：一条为生物合成的主要 途径，可被叶酸拮抗物（氨基蝶 呤）阻断；另一条为替代途径， 叶酸代谢受阻时，细胞 通过 HGPRT和TK，利用核苷酸前体 物合成核苷酸，进而合成DNA 。HAT培养液含三种成分：次 黄嘌呤、氨基嘌呤和胸腺嘧啶核 苷。
单克隆抗体和基因工程抗体的制备工艺
（三）抗体的表面修饰
人和鼠 IgV区来自不同的种属，轻链不同型 别 ， 互 补 性 决 定 区 (complementarity determining region,CDR) 的长度可不一致，但 暴露于表面的AA残基的位置数量都很保守，通过 改变表面残基使其人源化，降低鼠可变区的异源 性，将Fv的表面人源化，消除其免疫原性而不影 响 Fv 的整体空间构象。
单克隆抗体和基因工程抗体的制备工 艺
第三节 基因工程抗体技术 杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、 预防和蛋白质提纯应用中非常广泛， 但对人是异源性，人抗小鼠抗体，应 用基因工程技术减少小鼠源成分，保 留原有的抗体特异性。
单克隆抗体和基因工程抗体的制备工 艺
一、人源化抗体
人源化抗体主要指鼠源性单克隆抗 体的基因克隆及 DNA 重组技术改造， 重新表达的抗体。其大部分氨基酸序列 为人源序列所取代，既基本保留亲代鼠 单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低 了鼠异源性。
单克隆抗体和基因工程抗体的制备工 艺
( 二 ) 改 形 抗 体 （ reshaped antibody,RAB）
应用基因工程技术在嵌合抗体基础 上用人抗体可变区序列取代鼠源单抗CDR 以外的骨架序列，重新构成既有鼠源单 抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化 抗体，该抗体对人无免疫原性。
单克隆抗体和基因工程抗体的制备工 艺
单克隆抗体和基因工程抗体的制备工 艺
•
将阳性细胞进行单细胞培养，反复2～
3次，确保为一单细胞阳性杂交瘤细胞应及
时冻存，以防止细胞染色体丢失，发生变
异或污染，冻存于液氮（-196℃）,冻存时
加小牛血清至20%, 加几滴10%二甲亚砜。
• 杂交瘤细胞培养可用液体、半固体、接
克隆抗体与基因工程抗体
03 克隆抗体与基因工程抗体 的比较
制备方法的比较
克隆抗体
通过动物免疫反应，提取B淋巴细胞，分离出单克隆抗体。
基因工程抗体
利用重组DNA技术，设计和构建抗体基因，在细胞或微生物中表达抗体。
特异性的比较
克隆抗体
通常具有高特异性，针对特定抗原表位。
基因工程抗体
可以通过基因突变和亲和力成熟进一步提高特异性，实现更精细的抗原识别。
基因工程抗体的定义
基因工程抗体是指利用基因工程技术，在体外对免疫系统进行模拟或对抗体基因进 行克隆和表达，进而获得的抗体分子。
基因工程抗体是通过人工方法将抗体的基因进行重组、克隆和表达，从而在体外获 得具有特定结构和功能的抗体分子。
基因工程抗体可以克服传统抗体制备方法的限制，实现大规模、高效、定向的抗体 生产。
将产生抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，通过筛 选和培养获得稳定产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
转基因技术
将抗体基因克隆到表达载体中，转染到宿主细胞中，通过表达和纯 化获得抗体分子。
噬菌体展示技术
利用噬菌体展示技术将抗体片段展示在噬菌体表面，通过筛选获得 具有特异性的抗体分子。
02 基因工程抗体的概念
新型克隆抗体的研
发
针对不同疾病和靶点，研发具有 特殊功能的新型克隆抗体，以满 足临床治疗和诊断的需求。
降低免疫原性
通过基因工程手段对克隆抗体进 行改造，降低其免疫原性，提高 其在临床应用中的安全性和有效 性。
基因工程抗体的发展方向
1 2 3
人源化抗体
通过基因工程技术将鼠源抗体的可变区与人源抗 体的恒定区进行重组，形成人源化抗体，降低免 疫排斥反应。
克隆抗体与基因工程抗体
单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术
单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术掌握：1.杂交瘤技术的基本原理2.抗体工程的基本技术一、单克隆抗体技术（Monoclonal antibody，McAb）（一）概述：克隆（clone）：由单个细胞繁殖、扩增而形成性状均一的细胞集落的过程称为克隆。
多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb）：大多数抗原分子具有多个表位，每一种表位均可刺激机体一个B细胞克隆产生一种特异性抗体。
传统制备抗体的方法是用包含多种表位的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。
因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。
单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）：由一个仅识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，称为单克隆抗体−−→单个克隆→B−）淋巴细胞化学性质单一、特异性强的抗体（单克隆抗体细胞群①哺乳动物在感染病原体后，体内会形成多种相应的B淋巴细胞（浆细胞），因而产生多种特异性抗体。
②每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
多克隆抗体：劣势：均一性差、特异性低、排斥副反应强。
单克隆抗体：优势：活性专一、特异性强、纯度高、副反应弱。
（二）杂交瘤技术的基本原理1.杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特性。
2.细胞的选择与融合：(1)亲本1：经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。
(2)亲本2：肿瘤细胞，通常选择多发性骨髓瘤细胞（Sp2/0）。
其具备以下特点为：①与B细胞为同一体系，可增加融合的成功率②稳定、易培养③自身不分泌Ig或CK④融合率高⑤是HGPRT缺陷株3.融合剂（fusogen）①引起融合的病毒：副粘病毒②化学制剂：聚乙二醇（PEG）③细胞电融合技术：电脉冲（三）选择培养基的应用1.细胞融合是一个随机的物理过程。
融合后可能出现以下情况：①脾细胞与瘤细胞②瘤细胞与瘤细胞③脾细胞与脾细胞④未融合的瘤细胞⑤未融合的脾细胞⑥细胞多聚体形式2.杂交瘤细胞的选择性培养基——HAT培养基细胞的DNA合成一般有两条途径：(1)主要途径：糖和氨基酸→核苷酸→DNA(2) 替代途径：1) 细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：①次黄嘌呤（hypoxanthine，H）②甲氨蝶呤（aminopoterin，A）③胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）2)三者取前缀缩写为HAT培养基3)原理：叶酸作为重要的辅酶参与DNA主要合成过程，氨基喋呤是叶酸的拮抗剂，能阻断该主要合成途径。
主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备【精品】
第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备第一节杂交瘤技术的基本原理第二节单克隆抗体的制备第三节基因工程抗体制备第四节单克隆抗体的应用将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。
第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的原理是使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，成为杂交瘤细胞，最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。
将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。
一、杂交瘤技术包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化。
（一）小鼠骨髓瘤细胞细胞株稳定，易于传代培养。
细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。
该细胞是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株。
（二）免疫脾细胞免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法。
如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫。
（三）细胞融合PEG（聚乙二醇）可能导致细胞膜上脂类物质的物理结构重排，使细胞膜容易打开而有助于细胞融合。
（四）杂交瘤细胞的选择性培养HAT培养液，是在基础细胞培养液内添加次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷。
1.脾细胞（指B细胞）在一般培养基中不能生长繁殖。
2.骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT而合成DNA，骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡。
3.杂交瘤细胞由骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成的杂交瘤细胞。
由于与脾细胞融合，可获得其HGPRT，可以合成DNA。
因此，杂交瘤细胞在选择性培养得以生存而被筛选出来。
二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养单个细胞培养又称克隆化。
细胞克隆化有以下几种方法：1.有限稀释法；2.显微操作法；3.荧光激活细胞分选仪；4.软琼脂平板法。
三、阳性杂交瘤细胞的冻存目前均采用液氮保存细胞。
细胞放入液氮前，需要逐步降温。
复苏细胞时，从液氮罐内取出冻存管，立即浸入37℃水浴。
生物技术制药第四章 抗体工程制药：单克隆抗体基因工程抗体噬菌体抗体技术
第四章抗体工程制药第三节单克隆抗体的制备*原理制备流程原理书本84页单克隆抗体技术的原理是基于动物细胞融合技术得以实现的，即骨髓瘤细胞与B细胞的融合。
骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。
将免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特点，既有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成的分泌特异性抗体的能力。
@ 细胞融合后存在：脾细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞@ 筛选及抗体检测：HAT培养液：次黄嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T)，氨基蝶呤可阻断DNA的合成。
如细胞含有胸腺嘧啶激酶（TK）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）此两种酶则可启动补救（应急）途径。
次黄嘌呤，胸腺嘧啶在HGPRT作用下合成DNA的合成，并可克服氨基蝶呤的阻断。
在HAT培养液中，骨髓瘤细胞缺乏TK或HGPRT而不能生长，而脾细胞能生长但不能长期增殖而死亡，只有杂交瘤细胞具有以上两种酶故能生长。
脾细胞（HGPRT+, TK+, 不能长期生长）骨髓瘤细胞（HGPRT-, TK-，不能生长）杂交瘤细胞（HGPRT+, TK+ ，能够生长）单克隆抗体制备流程图书本85页！！！制备流程：抗原→受体动物→致敏B 细胞+骨髓瘤细胞（PEG）→杂交瘤（细胞培养（HAT 培养基）→阳性筛选—①体内培养②体外培养）→单克隆抗体；第四节基因工程抗体一、单克隆抗体人源化(humanized antibody)；降低ＨＡＭＡ反应；人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。
*人源化抗体种类特点概念二、小分子抗体*种类用途可以用图示表示包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。
基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子质量仅为原抗体的1/80-1/3(1)Fab片段抗体：VH+CH1 (2)FV抗体：VH+VL(3)单链抗体：VH-Linker-VL (4)单域抗体：VH或VL小分子抗体有很多优点:可以用细菌或酵母菌发酵生产，成本低;分子小，穿透力强;不含Fc，没有Fc带来的效应;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。
单克隆抗体和基因工程抗体的制备 ppt课件
课件
11
(二) 杂交瘤细胞的选择性培养
杂交瘤细胞的筛选： 两种亲本细胞经PEG或其他方法处理后， 可融合 成不同类型的融合体， 正常的脾细胞在培养基中存活 仅5~7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易 死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。 要从中筛选出真正的杂交瘤细胞， 必须进行选择 性培养。目前，常用HAT培养基。 HAT培养基：
课件 13
细胞DNA生物合成途径示意图
糖+氨基酸
正常途径
氨基喋呤(A)
次黄嘌呤(H) HMP
HGPRT
核苷酸Βιβλιοθήκη 核苷酸前体DNA应急途径
TK
胸腺嘧啶(T) 课件
TMP
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用来融合的瘤细胞是经毒性培养基选择 出来的缺乏 HGPRT 的细胞株，所以在 HAT选择培养基中不能生长。只有杂交 瘤细胞具有亲代双方的遗传特性，即既 有骨髓瘤细胞在体外无限繁殖的生命力 又有 B细胞经辅助途径合成 DNA 的能力， 故可在HAT培养基中长期存活并繁殖。
课件
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2．小鼠骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞为B细胞系恶性肿瘤，能在体外 长期增殖并容易与B细胞融合。
课件
8
用于杂交瘤技术的骨髓瘤细胞 应符合的条件
①本身不分泌免疫球蛋白； ②为次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转化酶 （hypoxanthine-guanine- phospheribosyl-transfer ase ， HGPRT ） 或 胸 腺 嘧 啶 激 酶 （ thymidinekinase，TK）缺陷的细胞株； ③瘤细胞能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞； ④与B细胞融合率高。
课件
3
第一节 杂交瘤技术的基本原理
克隆抗体与基因工程抗体的制备
基因工程抗体的制备流程
抗体基因的克隆和表达载体构建
从免疫动物或细胞中分离出抗体基因，并将其插 入到表达载体中，以便在宿主细胞中表达。
抗体分子的分离和纯化
从表达抗体分子的细胞中提取、分离和纯化抗体 分子，确保其质量和特异性。
ABCD
宿主细胞的转化和筛选
将构建好的表达载体导入宿主细胞，通过筛选获 得能够表达目标抗体的细胞株。
生物药物
单克隆抗体可以作为药物载体，用于 导向治疗和放射免疫显像技术等领域。
02
基因工程抗体的制备
基因工程抗体的概念
基因工程抗体是指利用基因工程技术 ，通过人工设计和合成抗体分子，以 实现对特定抗原的特异识别和结合。
基因工程抗体可以克服传统抗体制备 方法的限制，实现大规模、高效、定 向的抗体生产，为生物医学研究和治 疗提供更多可能性。
克隆抗体与基因工程 抗体的制备
目录
• 克隆抗体的制备 • 基因工程抗体的制备 • 克隆抗体与基因工程抗体的比较 • 未来展望
01
克隆抗体的制备
克隆抗体的概念
抗体克隆
指将免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤 细胞融合，形成杂交瘤细胞，并筛选 出能产生所需抗体的细胞系的过程。
单克隆抗体
杂交瘤细胞
融合后的杂交瘤细胞既具有瘤细胞无 限增殖的能力，又具有B淋巴细胞产 生抗体的功能。
03
克隆抗体与基因工程抗体 的比较
制备方法的比较细胞中提取出B淋巴细胞，经融合后形成 杂交瘤细胞，再筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞株，进行培养制备。
基因工程抗体
利用基因工程技术，将抗体的基因在细胞或微生物中进行表达，通过基因重组 技术构建抗体库，筛选出所需抗体。
抗体偶联技术
发展新型的抗体偶联技术， 将抗体与其他药物或放射 性标记物偶联，实现精准 治疗和诊断。
单克隆抗体与基因工程抗体制备技术
第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术本章考点1.概念2.杂交瘤技术基本原理3.杂交瘤抗体的制备技术4.基因工程抗体由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。
传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。
由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。
因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。
第一节杂交瘤技术基本原理单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。
杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
一、B细胞杂交瘤技术1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。
融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。
2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。
单克隆抗体与基因工程抗体制备
细胞融合
HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞
检测筛选阳性细胞
克隆化培养（反复3-5次）
获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株
McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）
2019/12/26
McAb 纯化及鉴定
单克隆抗体特性
• 优点： 理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种 抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于 实验标准化和大量制备
2019/12/26
融合后细胞的类型: 未融合的脾细胞 （寿命短，5-7天死亡） 杂交瘤细胞 （分泌抗体和永生性） 未融合的瘤细胞
2019/12/26
杂交瘤细胞的筛选与克隆化
细胞DNA合成途经
1.替代途径：次黄嘌呤（H）
HGPRT
2.主要途径：
氨基 酸
鸟嘌呤核苷酸
谷 氨 酰 胺 （A-）
尿核苷单磷酸
2019/12/26
阳性杂交瘤细胞的筛选
• 杂交瘤细胞在HAT中生长，其中仅少数 是分泌特异性McAb的细胞，而且有的培 养孔生长多个细胞群落，必须筛选。
• 一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开 始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤 细胞系。
• 可靠的筛选方法须在融合前建立，避免 由于方法不当贻误筛选时机。
胸腺嘧啶核苷酸
TK
3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）
2019/12/26
HAT选择培养基的原理
• HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)
2019/12/26
抗原免疫的脾细胞
小鼠骨髓瘤细胞
单克隆抗体与基因工程抗体制备
2019/12/26
单克隆抗体与基因工程抗体的制备共68页文档
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
单克隆社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备
第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。
第一节杂交瘤技术的基本原理一、杂交瘤技术（一）小鼠骨髓瘤细胞1.细胞株稳定，易于传代培养。
2.细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。
3.该细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷株。
4.目前最常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/O细胞株。
（二）免疫脾细胞选用与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠，鼠龄8～12周，体重约20g，雌雄均可，但必须分笼。
免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，多用腹腔内或皮内多点注射法。
如微量抗原，可脾脏内直接注射进行免疫。
（三）细胞融合PEG（聚乙二醇）有助于细胞融合。
（四）杂交瘤细胞的选择性培养将经过融合的细胞置于含有次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷的HAT培养基中。
1.脾细胞：在一般培养基中不能生长繁殖。
2.骨髓瘤细胞：采用的小鼠骨髓瘤细胞都是HGPRT或TK代谢缺陷型细胞，在HAT培养基中不能增殖。
3.杂交瘤细胞：骨髓瘤细胞与脾细胞融合，获得HGPRT，可以利用次黄嘌呤合成DNA，故可以存活。
二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存单个细胞培养又称克隆化。
细胞克隆化一般至少进行3～5次。
克隆化有以下几种方法：（一）有限稀释法操作简单，出现率高，为实验室最常用的方法。
（二）显微操作法直观可靠，但操作时间过长，容易增加污染机会。
（三）荧光激活细胞分选仪先进、高效、高纯度、昂贵。
（四）软琼脂平板法本法缺点是琼脂融化温度较难掌握，过高会导致细胞死亡，过低使细胞分布不均匀，操作较复杂，克隆出现率不稳定。
杂交瘤细胞应及时冻存，以保证细胞不会因污染或过多传代变异丢失染色体而丧失功能。
目前均采用液氮保存细胞。
（注意逐步降温、快速复温）第二节单克隆抗体的制备一、单克隆抗体的产生（一）动物体内诱生法目前McAb治疗用或体外诊断用的多采用该法。
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第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术
本章考点
1.概念
2.杂交瘤技术基本原理
3.杂交瘤抗体的制备技术
4.基因工程抗体
由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。
传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。
由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。
因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。
第一节杂交瘤技术基本原理
单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。
杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
一、B细胞杂交瘤技术
1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。
融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。
2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。
次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷是细胞DNA合成的途径；氨甲蝶呤（A）是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合作用的瘤细胞是经毒性培养基选取出的缺乏HGPRT细胞株，不能在该培养基上生长，只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT 培养基上长期存活与繁殖。
3.有限稀释与抗原特异性的选择：细胞融合是一个随机的过程，需在融合细胞抗体筛选的基础上进行特异性筛选。
将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株进行增殖，再进行冰冻，体外培养或动物腹腔接种。
图13 杂交瘤技术操作主要流程示意图
二、T细胞杂交瘤
T细胞杂交瘤可分为小鼠细胞杂交瘤和人T细胞杂交瘤。
其基本过程是将激活的细胞与酶缺陷型淋巴瘤细胞融合，通过有限克隆稀释，获得特异性表达细胞受体（TCR）或其他功能的杂交瘤细胞。
其主要步骤为：
1.淋巴瘤细胞系的选择要求有以下特征：
（1）体外能无限、快速生长。
（2）融合率高。
（3）不分泌淋巴因子和杀伤功能。
（4）缺乏某一特异性的细胞表面抗原或受体。
（5）HGPRT酶缺陷型。
2.特异性细胞的制备与活化：主要有可溶性抗原诱导激活的细胞、同种反应性细胞、人的特异性细胞等。
3.T细胞杂交瘤的筛选。
三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养
杂交瘤细胞形成后的初期很不稳定，为确保单克隆抗体的专一性及避免其他阴性细胞对其生长影响，必须将阳性杂交瘤细胞进行单细胞分离培养，产生单克隆杂交瘤细胞，经2～3次检测均为阳性的杂交瘤单个细胞，才能进行克隆化培养。
克隆化培养后的阳性杂交瘤细胞应及时冻存，最好保存在-196℃液氮中。
第二节单克隆抗体的制备技术
利用杂交瘤技术制备McAb基本原理是根据三个原则：（1）淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说；（2）杂交瘤细胞保持双方亲代细胞特性化；（3）然后大量培养增殖，制备所需的McAb。
一、单克隆抗体的产生
1. 动物体内诱生方法：目前McAb治疗用或体外诊断用的多数尚采用这一方法制备。
先在小鼠腹腔注射液体石蜡或福氏不完全佐剂，一周后将杂交瘤细胞悬液注射腹腔，l～2周后，无菌抽取腹水，离心取上清液即可。
2.体外培养法：这是实验室制备的方法。
将杂交瘤细胞置培养瓶中培养，待培养液颜色改变或细胞过多开始死亡时，收集上清液，离心去掉碎片及细胞即可。
另一种是杂交瘤细胞高密度培养法。
二、单克隆抗体的纯化及鉴定
目前常用的纯化方法有盐析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取等方法。
单克隆抗体性质鉴定方法如放免测定、补体介导溶血试验、ELISA、免疫酶、玫瑰花结形成试验等，最常用的为ELISA方法，一般先作定性试验，如阳性，进一步作定量检测。
第三节单克隆抗体医学中的应用
单克隆抗体目前全世界已研制成数以万计，在生物及医学界有着广泛用途，在医学中已经用于：
1.作为诊断试剂，用于诊断各类病原体，目前这是McAb应用最多的领域之一。
2.肿瘤特异性抗原和相关抗原的检测：用于肿瘤的诊断、分型及定位。
3.检测淋巴细胞表面标志物，用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。
4.抗原微量成分的检测及对酶类、激素、维生素、药物等的检测。
5.在防治工作中如恶性肿瘤的治疗，“生物导弹”的研制等都有广泛前景。
6.研究工作中用作“探针”，确定大分子生物物质在细胞中的分布及位置。
7.用于抗原物质的提取及纯化。
第四节基因工程抗体技术
由于杂交瘤单克隆抗体为异源性蛋白，应用于人时易产生抗小鼠抗体，基因工程抗体通过基因工程技术改造现有优良的鼠单克隆抗体基因。
尽量减少抗体中鼠源成分，保留原有抗体特异性，从而创造出一种新型抗体。
一、人源化抗体
人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。
1.人-鼠嵌合抗体
此抗体为通过基因工程技术，将人IgG C区与鼠IgV区连接，导入细胞内表达制备而成的抗体。
2.抗体的表面修饰，使Fv表面人源化。
二、小分子抗体
此为分子量小，具有抗原结合功能的分子片段，包括Fab，Fv，单链抗体，单区抗体等。
此种抗体分子量小，可在大肠杆菌等原核细胞表达，在人体内穿透力强，有利于疾病的治疗。
三、抗体融合蛋白
将抗体分子片段与其他蛋白融合，可得到多样性生物功能的融合蛋白，如：
1.含Fv段的抗体融合蛋白：将Fv与某些毒素、酶、细胞因子基因拼连，通过这些抗体的引导，可将其生物活性物质导向靶细胞特定部位，所谓“生物导弹”。
2.嵌合受体：将ScFv与某些细胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白，可表达于细胞表面，称为嵌合受体，由于其介导的杀伤效应不受MHC限制，在过继性免疫治疗中有潜在应用价值。
3.含Fc的抗体融合蛋白：CD4分子细胞膜外部分与Fc融合后由真核细胞表达。
此融合蛋白能竞争结合HIV，阻断HIV对敏感细胞的感染；还可介导ADCC及CDC，可通过胎盘。
四、双特异性抗体
双特异性不同的两个小分子抗体连接在一起可得到双特异性抗体。
双特异性抗体能同时结合两种抗原，因而可介导标记物与靶抗原结合或某些效应因子定位于靶细胞，在免疫学检测中可简化操作步骤，提高检验质量；应用双特异性抗体介导的药物杀伤效应可用于肿瘤等的治疗。
五、抗体库技术
抗体库技术是指基因克隆技术将全套抗体重链及轻链可变区基因克隆出来，重组到质粒表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，最后筛选到特异的可变区基因，现有组合抗体库技术及菌体抗体库技术。
习题26 制备单克隆抗体常选用小鼠的哪类细胞作为饲养细胞
A.中性粒细胞
B.K细胞
C.肥大细胞
D.成纤维细胞
E.腹腔细胞
[答疑编号500728040101]
『正确答案』E
习题27 目前实验室常用的克隆化方法是
A.显微镜操作法
B.有限稀释法
C.软琼脂平板法
D.流式细胞仪筛选法
E.免疫法
[答疑编号500728040102]
『正确答案』B
『答案解析』将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化。
习题28 能在HAT培养基生长繁殖的细胞是
A.小鼠脾细胞
B.小鼠骨髓瘤细胞
C.饲养细胞
D.杂交瘤细胞
E.免疫活性细胞
[答疑编号500728040103]
『正确答案』D
『答案解析』细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。
只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT培养基上长期存活与繁殖，而骨髓瘤细胞是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，不能生长。