乙酰半胱氨酸微生物限度方法学验证

取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上， 出滤膜，接种至 100 mL 胰酪大豆胨液体培养基中，于
于 30~35 ℃倒置培养不超过 3 d（操作方法同试验组）， 30~35 ℃培养 18~24 h，备用。
·110·
生物化工
2021 年
1.7 回收率计算
霉菌和酵母菌总数检查验证（平皿法）结果见表 2，控
需氧菌总数检查验证（薄膜过滤法）结果见表 1，
菌种名称 金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌
白色念珠菌 黑曲霉
批次
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
菌种名称 白色念珠菌
黑曲霉
批次
1 2 3 1 2 3
表 1 需氧菌总数检查验证结果
各组菌数
试验组 菌液组 供试品对珠菌 [CMCC（F)98001]、黑曲霉 [CMCC
1 材料与方法
（F）98003]、大肠埃希菌 [CMCC（B）44102]，北京
1.1 仪器与试剂
三药科技开发公司。
LRH － 150、MJ150-1 生化培养箱，上海索谱仪
胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基，
器有限公司；XG1.G 脉动真空灭菌器，山东新华医疗 北京三药；胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体
前体，曾用作黏液溶解剂和对乙酰氨基酚中毒的治 疗 [1]。其在调节免疫、抗感染、抗毒素等领域中也具
1.2 菌种与培养基 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003]、铜绿假单
有独特优势。本文基于《中国药典》2015 版对该药 胞菌 [CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）
品的微生物限度检查方法进行了验证。
作者简介：王淑玲（1983—），女，江苏沛县人，本科，工程师，研究方向：生物化工。
第3期
王淑玲等：乙酰半胱氨酸微生物限度方法学验证
·109·
1.3 溶液制备
点计菌落数。
接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单 1.5 霉菌和酵母菌总数检查验证（平皿法）
胞菌培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，于 30~35 ℃ 1.5.1 试验组
液，用缓冲液稀释制成 1 ∶ 50 的供试液。
1.5.4 阴性对照组
1.4 需氧菌总数检查验证（薄膜过滤法）
取缓冲液 1 mL 加入平皿中，加入 45 ℃的沙氏葡
1.4.1 试验组
萄糖琼脂培养基 15~20 mL，混匀，凝固，于 20~25 ℃
取 1 ∶ 50 的 供 试 液 9.9 mL 和 ≤ 10 000 cfu/mL 倒置培养不超过 5 d，点计菌落数。
器械股份有限公司；1384-A2 生物安全柜，赛默飞； 培养基，青岛日水生物技术有限公司；麦康凯液体培
PL202-L 电子天平，METTLER TOLEDO；EZ 自动微 养基、麦康凯琼脂培养基，BD；pH 7.0 无菌氯化钠 -
生物过滤检验装置，密理博。
蛋白胨缓冲液（以下简称缓冲液），扬子江药业集团。
第7卷 第3期 2021 年 6 月
生物化工 Biological Chemical Engineering
文章编号：2096-0387（2021）03-0108-03
Vol.7 No.3 Jun. 2021
乙酰半胱氨酸微生物限度方法学验证
王淑玲 1,2
（1. 扬子江药业集团南京海陵药业有限公司，江苏南京 210000；2. 南昌大学，江西南昌 330000）
Keywords: N-acetylcysteine; Microbial limit methodology; Validation
N- 乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是含
乙 酰 半 胱 氨 酸（批 号 201904014、201905008、
巯基（-SH）的还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH） 201908005），武汉远大弘元股份有限公司。
的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、 1.6 控制菌 - 大肠埃希菌检查验证（薄膜过滤法）
白 色 念 珠 菌 等 菌 悬 液、黑 曲 霉 孢 子 悬 液 0.1 mL 混 1.6.1 阳性对照组
匀后，取 1 mL 加入约 50 mL 缓冲液过滤（滤膜已用
取 1 ∶ 10 的供试液 10 mL 和缓冲液 50 mL，用已
0
97
95
0
100
97
0
90
60
0
93
62
0
88
60
0
51
42
0
47
43
0
50
45
0
38
26
0
37
27
0
33
28
0
51
42
0
50
42
0
46
43
0
表 2 霉菌和酵母菌总数检查验证结果
试验组 47 49 50 48 45 44
各组菌数
菌液组
供试品对照组
53
0
49
0
55
0
46
0
43
0
45
0
阴性对照 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
摘 要：目的：建立验证乙酰半胱氨酸的微生物限度检测方法。方法：用薄膜过滤法、平皿法验证所采用的方法是否适合该 药品微生物限度检查方法。结果：需氧菌检查、控制菌检查采用薄膜过滤法，霉菌和酵母菌数检查采用平皿法，试验菌的回收率 均在 0.5~2.0 范围内。结论：该方法可用于乙酰半胱氨酸的微生物限度检查。
批次
阳性对照组
1
﹢
2
﹢
3
﹢
注：+ 表示阳性，- 表示阴性。
供试品对照组 -
阴性对照组 -
3 结论
乙酰半胱氨酸的需氧菌检查、控制菌检查采用薄
膜过滤法，霉菌和酵母菌数检查采用平皿法，试验菌 的回收率均在 0.5~2.0，方法可行。 参考文献
[1] Elbini D I, Jallouli M, Annabi A, et al. A minireview on N-acetylcysteine:an old drug with new approaches[J].Life Sci,2016,151:359-363.
关键词：乙酰半胱氨酸；微生物限度方法学；验证 中图分类号：R927 文献标识码：A
Validation of Microbial Limit Methodology for N-acetylcysteine
WANG Shuling1,2 (1.Yangtze River Pharmaceutical Group Nanjing Hailing Pharmaceutical Co., Ltd., Jiangsu Nanjing 210000;
阴性对照组 0 0 0 0 0 0
回收率 /%
1.0 1.0 1.0 1.5 1.5 1.5 1.2 1.1 1.1 1.5 1.4 1.2 1.2 1.2 1.1
平均回收率 /% 1.0 1.5 1.1 1.4 1.2
回收率
0.9 1.0 0.9 1.0 1.0 1.0
平均回收率 0.9 1.0
表 3 大肠埃希菌检查验证结果
大肠埃希菌培养物制成含菌数≤ 100 cfu/mL 的菌悬 1.5.2 菌液组
液。接种黑曲霉培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基，于
取缓冲液 9.9 mL，其他均同试验组操作方法。
20~25 ℃培养 5~7 d，加入含 0.05% 的聚山梨酯 80 的 1.5.3 供试品对照组
缓冲液，制成含菌数≤ 10 000 cfu/mL 的菌悬液。
50 mL 缓冲液润湿），冲洗 5 次，每次 100 mL。取出 润湿滤膜过滤、冲洗（每次 100 mL，冲洗 3 次），在最
滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，于 后一次冲洗液中加入不大于 10 000 cfu/mL 的菌悬液
30~35 ℃倒置培养不超过 3 d，过滤白色念珠菌菌悬 1 mL，冲洗结束后，取出滤膜，接种至 100 mL 胰酪
取 1 ∶ 10 的 供 试 液 1 mL 加 入 平 皿 中，加 入
取样品 10 g，加 90 mL 缓冲液，再加入 6 mol/L 的 45 ℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基 15~20 mL，混匀，凝
氢氧化钠溶液 10 mL，充分混匀，制成 1 ∶ 10 的供试 固，于 20~25 ℃倒置培养不超过 5 d，点计菌落数。
液、黑曲霉孢子悬液的平皿于 30~35 ℃倒置培养不超 大 豆 胨 液 体 培 养 基 中，于 30~35 ℃ 培 养 18~24 h，
过 5 d，点计菌落数。
备用。
1.4.2 菌液组
1.6.2 供试品对照组
取缓冲液 9.9 mL，其他均同试验组操作方法。
取 1 ∶ 10 的供试液 10 mL 和缓冲液 50 mL，用
培养 18~24 h；接种大肠埃希菌液体培养物胰酪大
取 1 ∶ 10 的供试液 9.9 mL 分别和白色念珠菌
豆胨液体培养基中，于 30~35 ℃培养 18~24 h，接种 悬液（含菌数≤ 10 000 cfu/mL）及黑曲霉孢子悬液
白色念珠菌液体培养物至沙氏葡萄糖液体培养基， （含孢子数≤ 10 000 cfu/mL）各 0.1 mL 混匀，吸取
胰酪大豆胨琼脂培养基上，于 30~35 ℃倒置培养不超 18~24 h，备用。
过 3 d（操作方法同试验组），点计菌落数。
1.6.3 阴性对照组
1.4.4 阴性对照组
取缓冲液 50 mL，用滤膜（已用缓冲液润湿）过
取缓冲液 50 mL，过滤、冲洗 5 次，每次 100 mL。 滤、冲洗（每次 100 mL，冲洗 3 次），冲洗结束后，取
于 20~25 ℃培养 18~24 h，分别将金黄色葡萄球菌、 1 mL 加入平皿中，加入 45 ℃的沙氏葡萄糖琼脂培养
枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌培养物 基 15~20 mL，混匀，凝固，于 20~25 ℃倒置培养不超
用缓冲液制成含菌数≤ 10 000 cfu/mL 的菌悬液，将 过 5 d，点计菌落数。
2.Nanchang University, Jiangxi Nanchang 330000)
Abstract: Objective: Establishment of microbial limit test method for N-acetylcysteine. Methods: The membranefilter method and plate method were used to verify whether the method adopted is suitable for the microbial limit test of the drug. Results: The total aerobic bacteria count and the control bacteria adopted the membrane-filter method,the total molds and yeasts count adopted the plate-count method.,The recoveries of the strains were all in the range of 0.5~2.0. Conclusion: This method can be used for the microbial limit test of N-acetylcysteine.
1.4.3 供试品对照组
滤膜（已用 50 mL 的缓冲液润湿）过滤、冲洗（每次
取缓冲液 50 mL 和 1 ∶ 50 供试液 1 mL，过滤、 100 mL，冲洗 3 次），冲洗结束后，取出滤膜，接种至
冲洗 5 次，每次 100 mL。取出滤膜，菌面朝上，贴于 100 mL 胰酪大豆胨液体培养基中，于 30~35 ℃培养
根据公式（1）计算回收率。
制菌 - 大肠埃希菌检查验证（薄膜过滤法）结果见表 3。
各菌株回收率（%）= 试验组菌数-供试液对照组菌数 ×100 菌液组菌数

2 结果与分析
（1）
回收率数据表明，需氧菌检查、控制菌检查采用薄膜 过滤法，霉菌和酵母菌数检查采用平皿法，试验菌的 回收率均在 0.5~2.0，方法准确度高。