CD34绝对计数
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抗凝剂的选择
不同的抗凝剂抗凝、标本的稳定性不同。EDTA抗凝的
标本,常温下可保存12-24h,肝素钠或枸橼酸钠抗凝的
标本可保存48h。
如果标本需用血细胞分析仪
同时进行白细胞计数和分类,则应选择EDTA抗凝。
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抗凝剂的选择
1、外周血标本常选用EDTA盐抗凝,2、采集物常
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造血干细胞的数量是造血干细胞移植 关键因素
成功的
造血干细胞移植
成功的关键
造血干细胞的数量
恶性血液病
某些实体瘤
免疫性疾病 免疫缺陷病
心肌 血管 胰岛细胞
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造血干细胞的检测方法
如何准确地计数造血干细胞的数量,什么是有效的质量 控制成了各大实验室探讨的焦点。 常用的方法: 集落培养法 流式细胞术CD34+细胞计数法
淋巴细胞
R5
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双平台ISHAGE设门
(1)CD45/SS R1包括所有CD45+及dimCD45。R5为 淋巴细胞
(2)CD34/SS。显示R1门内细胞。R2包括所有 CD34+细胞,从低SS到中等SS强度。
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双平台ISHAGE设门
(3)CD45/SS。显示R1+R2门内细胞。R3确认 CD34+细胞位于低CD45与低SS区域,为真正 CD34+细胞。
白细胞浓度与抗体用量同单平台方法,不需要采用已 知数量的荧光微球管或加入荧光微球悬液。裂解红细胞 的时间和方法按照所用溶血素说明书进行,裂解红细胞 后进行离心洗涤2次。
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免疫荧光染色
可采用商品化CD34+细胞计数试剂盒或实 验室自己组合的单抗。
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免疫荧光染色
流式细胞术 CD34+细胞计数
河南省人民医院血液病研究所 翟亚萍
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概论
造血干细胞移植(HSCT)是治疗血液系统疾病、 自身免疫性疾病、某些实体瘤和基因缺陷等疾病的 重要手段之一。在造血干细胞移植过程中采集足够 数量的造血干细胞是造血干细胞移植成功的关键。
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概论
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白细胞浓度和抗体用量
通过计数板计数或使用血细胞分析仪预先计算标 本中的白细胞浓度,并严格按照操作说明书调整标本 和抗体的最佳比例。
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白细胞浓度和抗体用量
白细胞过少的标本应减少单抗用量;白细胞过多 的标本应使用含1%白蛋白或其他蛋白的PBS稀释到适 当浓度。
但至今为止,尚无一个与体内重建造血全吻合的造血干 细胞体外检测法。
早期通过有核细胞计数、集落形成单位来计算移植物中 造血干/祖细胞数量,但前者与造血干细胞数量一致性差, 后者实验变异性大、耗时长,其临床使用价值低。
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概论
20世纪80年代,发现CD34分子在造血干/祖细胞上 表达,为临床 HSCT提供了可评价造血干/祖细胞植入 最低阈值的强有力的依据。
双平台双色CD34+细胞计数设置: CD45/SSC、CD34/SSC、 CD45/SSC、 FSC/SSC、CD45/CD34、FSC/SSC 6个散点图。
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双参数荧光散点图的设置
单平台三色CD34+细胞计数设置:CD45/SSC、 CD34/SSC、 CD45/SSC、FSC/SSC,CD45/CD34、 FSC/SSC、7-AAD/SSC、7-AAD/SSC 8个散点图。
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抗体组合方案
含7-氨基放线菌素D(AAD)的三色方案:抗体组合为 CD45,CD34,7-AAD; 不含7-AAD的双色方案:抗体组合为CD45,CD34。
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免疫荧光染色
按照试剂说明书和注意事项进行操作,一般 流程如下:
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标本与抗体孵育
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集落培养法: 优点:干细胞计数结果与移植结果相吻合 缺点:很难标准化,只代表晚期干/祖细
胞,培养时间长,不能当即判断采 集物的造血干细胞数量。
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流式细胞术CD34+细胞计数法: 优点:干细胞计数结果与移植结果相吻合
快速,简单,方便。 目前已取代了集落培养法
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标本运送
采集标本应该在2-6℃环境下尽快送检,注意避免 标本冻结和过热。
内部送检可用具有防漏密封的塑料袋和带盖的 塑料容器等运送标本。
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标本运送
外部运送标本,包装要求含有三层体系:防水 内容器;防水并含有吸附材料的第二层内容器;坚 固的外包装。致病原血液标本应严格按照有关规定 运送。
用枸橼酸钠凝,
3、骨髓和脐血标本可选
用EDTA、
肝素或ACD 抗凝。
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标本质量
标本处理的步骤越多,细胞丢失就越多。对于全血 标本,溶血后不洗涤,可以使标本处理的步骤减到最 少,细胞丢失少。
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标本质量 (标本目测)
标本常见问题有两种类型:
1 、变性或损
坏的标本,需立即弃之; 2、标本在处理过程中出现
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标本标识
造血干细胞采集完成后立即抽样,抽样前要将采 集袋中的细胞与小辫中的采集物混合5次以上,再封 闭小辫,剪取小辫中的采集物,在小辫上标记供者编 号、姓名及标本名称,送实验室检测。
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标本标识
所有检测标本应及时贴上标签,注明 患者姓名,标本类型,采集时间,申请单和标本粘贴在 一起送检,申请单要详细填写患者的信息、标本类型及 检测项目,进行双平台检测时还需提供白细胞计数和分 类。
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对照标本
对照通常采用同型对照和阳性对照标本 同型对照:采用ISHAGE设门方法时可不 需同型对照,多重逻辑设门后可去除非 特异性抗体结合;
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对照标本
阳性对照:检测新批号和当前批号试剂的染色效率是否 有问题时需要做阳性对照,或怀疑试剂出现问题时,采 用该试剂与已知可接受性能批号的试剂同时操作进行验 证。
数据的获取和分析
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细胞的获取
设定阈值和分辨率:根据仪器操
作说明书和试剂盒使用说明书进
行设定。
调整细胞群分布:在CD45/SSC散
点图中,调整SSC,使所有的白细
胞群均可见。
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根据CD45划定白细胞区域
作CD45/SSC散点图定位白细胞群,排除标本中细胞
错误操作,则 需进一步评价。错误操作问题需要记录
下来,这对标本的处理、分析以及结果地解释将很有帮
助。
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标本质量 (溶血、凝血)
1、严重溶血的标本应该放弃检测。所 有可能破坏标 本完整性的异常情况均应密切观察,并记录下来。 2、即使很小的凝块也会引起血液中某些成分的选择性 丢失或改变,凝血的标本应尽可能弃用。
碎片等对计数的干扰;
CD45从强阳
性到弱阳性,包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、原
始细胞、嗜碱性粒细胞和有核红细胞。
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采集细胞数
在非设门荧光散点图中,至少收集50000个 白细胞及100个CD34+细胞。
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CD34+细胞计数
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双参数荧光散点图的设置
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标本质量(温度极限)
经过长距离或长时间运送的标本,应确认标本是 否过热或过冷,即使其他所有的鉴定标准都正常,也 应该记录下来以利于后续的处理、分析和结果解释。
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标本质量(错误标本)
如果标本没有标签或标签与病人信息不符,应 拒绝接收标本,并及时与相关医护人员沟通
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CD34+细胞绝对计数方法
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CD34+细胞绝对计数方法
CD34+细胞绝对计数分为单平台方法和双平台方 法。单平台方法是首选方法,它避免了室间变异和 多台仪器间的系
单平台计数
•单平台:在抗体染色的细胞中,等容量加入确定浓度 的荧光微球,直接用FCM检测出采集物中的CD34+浓 度,然后计算出采集物中的CD34+细胞总数
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离心
为避免荧光微球的丢失,单平台计数在裂解红细胞后 不用离心洗涤。
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双平台方法
•双平台:分别用FCM检测出CD34+细胞在有核细胞中的比 例,用血液细胞计数仪检测出有核细胞浓度,在光镜下 进行白细胞分类,然后再计算出采集物中CD34+细胞总数。
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双平台方法
涤、双平台 ▲设门CD45/SSC,CD34/SSC,
FSC/SSC,CD45/CD34
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R1 R5
R1
R3 R2
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双平台ISHAGE设门
标记 G1 G2 G3 CD34+细胞
定义 R1 R1 and R2 R1 and R2 and R3 R1 and R2 and R3 and R4
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设门方法
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双平台ISHAGE设门
白细胞计数需要与CD34+细胞计数使用同一 标本检测,并在6h内完成。当白细胞计数不能 准确获得时,不能用双平台方法,只能用单平 台方法。
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基本的ISHAGE:双平台法
▲试剂:CD45-FITC,CD34-PE ▲全血,直接荧光标记,溶血、洗
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移液量
标本和荧光微球的移液量应精确,确保准确计数 加入的定量微球的浓度和标本体积,推荐采用反向抽 吸法加样。
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裂解红细胞
裂解时间和方法按照所用溶血素说明书进行操作。 采用含7-AAD方案时应选择不含固定剂的溶血素,如 氯化铵-Tris缓冲液。
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概论
近年来尽管体外研究表明,人类CD34-脐血干细胞也有 造血活性,但大量的临床研究证实用富含CD34+细胞移植 可安全、持久地重建多系造血。因此,目前临床及实验室 仍然是应用CD34+细胞进行造血干细胞移植、基因转染等。
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概论
而流式细胞仪具有CD34+细胞计数准确、方便、快 捷等优势,已广泛地应用于造血干/祖细胞数量的检 测及采集时机的确定。
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对照标本
阳性对照的种类:主要有全血标本,冻干 淋巴细胞; 使用频率:更换试剂时
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流式细胞仪的质控
包括光学系统的调整、荧光分辨率的调整、荧光补偿的 调整、性能评估及比例、仪器保养及记录等。仪器的调 整很多方面要遵从制造商的建议。
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取含1×106白细胞的全血或稀释的标本50μ L200μ L加入适量直标抗体10μ L-20μ L,室温孵育 20min-30min。
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裂解红细胞
裂解时间和方法按照所用溶血素说明书进行操作。 采用含7-AAD方案时应选择不含固定剂的溶血素,如 氯化铵-Tris缓冲液。
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离心
离心洗涤方法与溶血素有关,按照所用溶血素说明 书进行操作。单平台绝对值计数法在裂解红细胞后, 不要离心洗涤
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绝对计数的商品化荧光微球
采用包被有已知数量的荧光微球或按说明书加 入一定数量的荧光微球。
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染色后标本保存
制备好的标本在上机分析前放在4-10℃下避光保存, 应在1h内上机检测,检测前混匀细胞。
自己组合的抗体中,每一种抗体都需分别滴定,以 明确其噪音与阳性信号的最佳分离滴度,并检测作为 组合抗体使用和作为组合抗体成分之一单独使用的平 均荧光强度和阳性率,其可比性需要在均值±2标准 差之内。
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抗体及荧光微球的选择
CD34抗体:选择PE直标的抗Ⅲ类抗体; CD45抗体:选择广谱的抗CD45抗体; CD34抗体同型对照:采用与CD34匹配的同一 厂家生产的同 型对照; 定量荧光微球:推荐使用绝对计数的商品化荧光微球。
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标本质量(标本保存时间及条件)
可接受的标本最长保存时间取决于抗凝剂的种类、 溶血剂、储存条件及细胞浓度。实验室应该根据使用 的抗凝剂和溶血剂确定可接受的标本最长保存时间。
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标本质量(标本保存时间及条件)
原则上标本采集后应立即检测,但是实际操作中 往往无法做到。不能立即检测的标本应该保存于2-6℃ 冰箱中。标本的处理和免疫染色应严格按照试剂说明书 进行。