膝柄木三个单株RAPD的亲缘关系

膝柄木三个单株RAPD的亲缘关系
安家成;张照远;黄妹平
【摘要】以膝柄木(Bhesa sinica)3个单株为研究对象,用RAPD技术对其亲缘关系进行分析.从96个随机引物中筛选出17个,对所有供试材料进行扩增,共获得52个DNA条带,其中30条为多态性条带,其多态性条带比率为57.69％.采用UPGMA法对RAPD结果进行聚类分析,可得出单株B和D亲缘关系较近,B、D两单株与单株A亲缘关系较远.
【期刊名称】《广西林业科学》
【年(卷),期】2017(046)004
【总页数】3页(P406-408)
【关键词】膝柄木;RAPD;亲缘关系;聚类分析
【作者】安家成;张照远;黄妹平
【作者单位】广西壮族自治区林业科学研究院广西优良用材林资源培育重点实验室国家林业局中南速生材繁育重点实验室,南宁 530002;广西壮族自治区林业科学研究院广西优良用材林资源培育重点实验室国家林业局中南速生材繁育重点实验室,南宁 530002;广西壮族自治区林业科学研究院广西优良用材林资源培育重点实验室国家林业局中南速生材繁育重点实验室,南宁 530002
【正文语种】中文
【中图分类】S794.9
膝柄木（Bhesa sinica）是卫矛科（Celastraceae）膝柄木属植物，于1979年在广西合浦县南康镇首次发现，1990年在防城港江平镇巫头村又发现了一个新的分布点[1]。

膝柄木主要分布于东南亚热带地区，而在我国西南部发现的膝柄木是该属分布最北的种类，其对研究我国植物区系有着重要的科学价值。

1996年组织的历时5年的中国重点保护野生植物资源的调查结果将膝柄木列入中国野生植物受威胁定量评估等级中的红色警报类“几乎绝迹（现存植株≤10株）”的高危等级[2]。

在随后的调查中发现，防城港市有膝柄木大小单株19株。

膝柄木属植物在我国的发现，不仅使我国的植被记录添了一个新的属种，而且是我国和印度、东盟十国等国家的植物区系之间得到了联系[3]，因此，对濒危膝柄木保护的意义重大。

我国对珍稀濒危植物的保护主要有两种方式，分别为迁地保护和就地保护[4]。

现存的膝柄木大多因为比邻社山的缘故能够实现就地保护。

但是，膝柄木的种子很少而且大多不育，实生苗稀少，导致迁地保护方式难以实现[5]。

现存膝柄木地理位置相距太远，而且其种子发芽率低[6]，导致通过有性繁殖方式来恢复种群极为困难。

莫竹承等对膝柄木叶片诱导愈伤组织[7]进行等研究，以寻找膝柄木无性扩繁途径，截至目前，仍未能真正实现膝柄木高效无性扩繁。

现今对膝柄木的研究和保护，还仅限于寻找发现更多的野生植株或者繁殖后代，并重点就地保护起来。

随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术是基于PCR和电泳发展起来的一种分子标记技术，其扩增产物的多态性能够反映基因组的多态性。

目前，该技术已对杨树[8]、红豆杉[9]等多个树种进行了品种鉴定和遗传多样性分析等研究，并取得了一定的成果。

因此，对膝柄木进行RAPD亲缘关系研究，了解单株之间遗传的差异性，有助于对膝柄木繁殖的研究。

本研究以膝柄木3个单株为研究对象，采用RAPD技术对其进行亲缘关系分析，旨在分析
3个单株间的亲缘差异，进而确定其遗传差异，为膝柄木的种质资源保护及品种鉴定提供理论依据。

1 材料和方法
1.1 材料
样品分别采自防城港市东兴江平镇班埃村和巫头村，记为A（班埃，21°36′37″E、108°11′26″N），树龄 108 a；B（巫头村养老院内，21°32′36″E、
108°8′23″N），树龄58 a；D（巫头村古井旁，21°32′56″E、108°8′20″N）树
龄4.5 a。

1.2 DNA提取
取样品叶片，沿叶脉剪碎（去掉叶柄），加入液氮研磨，研磨充分后，按照试剂盒EZgeneTM CP plant miniprep操作方法提取DNA。

随后采用分光光度计测定DNA浓度，并将浓度调整至100 ng/μL，置于-20℃冰箱待用。

1.3 PCR扩增
PCR扩增所用引物为RAPD随机引物96个。

PCR反应体系为20 μL：其中包括10×PCR Buffer 2 μL，Mg2+1.6 μL，dNTPs 0.5 μL，随机引物2μL，DNA（100ng/μL）1μL，Taq聚合酶0.2μL。

PCR扩增程序为：94℃预热5 min,然后在94℃1 min，36℃1 min，72℃1 mim 程序下循环35次，最后在72℃延伸10 min。

PCR产物与loading buffer混合后进行丙烯酰胺凝胶电泳。

1.4 扩增条带的统计和分析
电泳图谱中的每一条带（DNA片段）作为一个分子标记，根据各分子标记的迁移
率及有无，分别记为1或0。

采用NTSYSpc软件对统计结果进行分析，并构建3个单株的聚类分析树状图。

2 结果与分析
从96个随机引物中筛选出17个RAPD引物对3个样品进行RAPD标记分析，共在52个位点上扩增出条带，其中30条具有多态性。

多态性位点占57.69%。

引物1246、1242扩增出来的条带数最多，同时条带多态性最高，达到100%（表1）。

表1 膝柄木3个单株DNA扩增产生的RAPD位点统计Tab.1 Statistics of RAPD loci produced by DNA amplification of three individuals ofBhesa sinica?
根据RAPD标记数据计算材料间的遗传相似系数矩阵，采用UPGMA法，用NTSYSpc分析遗传多样性差异，构建了3个样品间的遗传关系聚类图（图1），经分析可知，单株B和D首先聚类，相似系数为0.65，随后再与单株A聚类，相似系数为0.58。

图1 膝柄木3个单株的遗传关系树状图Fig.1 Dendrogram of genetic relationship of three individuals ofBhesa sinica
3 结果与讨论
曲土松等[10]在用RAPD法分析鉴定大白菜的亲缘关系试验中，仅用2个随机引物即可检测到不同白菜中的特异性片段，且品种之间的差异也比较明显，从而证实RAPD标记检测不同样品间的亲缘关系是可行的。

本研究用17个RAPD引物对膝柄木3个单株进行谱带分析，可检测到不同单株间的特异性片段。

基于RAPD标记建立的树状图来看，膝柄木的3个单株的遗传距离都大于零，单株B和D首先聚类，最后与单株A聚类，表明膝柄木3个单株之间既有相同的遗传背景，但相互之间又存在一定的差异。

而且，单株B和D之间的遗传差异较小，与单株A的遗传差异较大。

由于膝柄木的稀少性，膝柄木是否有变种、变型等尚无研究。

从本试验结果看，单株A和单株B、D之间的遗传差异较大，单株A和B之间的关系需再进行深入的比较分析。

从生长地理位置来看，单株B和D距离较近，而单株A和B、D之间的地理间距
较远。

距离相近的单株B、D之间，单株B是成年乔木，D是幼苗。

单株D有可
能是单株B繁衍的后代、其亲缘关系较近，RAPD标记试验的结果分析也证实了
这一点。

在后续膝柄木繁殖的研究当中，一方面，着重对单株B的繁殖方式进行
深入研究；另一方面，可利用本研究建立起的RAPD分析鉴定技术对全分布区的
膝柄木进行系统的亲缘关系分析，获得膝柄木的遗传图谱，为膝柄木的遗传和保护提供更多的参考价值。

参考文献
［1］宁世江，邓泽龙，蒋运生.防城发现膝柄木的新分布点［J］.广西植物，1993（2）：94.
［2］顾云春.中国国家重点保护野生植物现状［J］.中南林业调查规化，2003，22（4）：1-7.
［3］梁盛业.珍稀濒危植物——膝柄木［J］.植物杂志，1992（3）：7
［4］莫竹承，范航清，李蕾鲜，等.濒危植物膝柄木生存现状及其恢复对策［J］.
广西科学院学报，2008，24（2）：134-137.
［5］吴小巧，黄宝龙，丁雨龙.中国珍稀濒危植物保护研究现状与进展［J］.南京
林业大学学报：自然科学版，2004，28（2）：72-76.
［6］钟国贵，谢绍添，苏付保，等.珍稀濒危植物膝柄木种子催芽研究［J］.北方
园艺，2016，（5）：83-85.
［7］莫竹承，庞万伟，刘钰，等.膝柄木叶片诱导愈伤组织研究［J］.中南林业科
技大学学报，2015，35（10）：13-17.
［8］汪建亚，林英司.运用RAPD发识别杨树品种技术的研究［J］.湖北林业科技，2000（S1）：8-13.
［9］徐霞，瞿印权，张玲玲，等.基于RAPD的福建产南方红豆杉遗传多样性研
究［J］.中草药，2017，48（14）：2943-2949.
［10］曲土松，黄宝勇，石琰，等.RAPD法分析鉴定大白菜的亲缘关系［J］.青岛农业大学学报（自然科学版），2002，19（2）：108-111.。