课件9：5.3 血红蛋白的提取和分离

3.电泳法 （1）概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
（2）原理： 分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不 同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 （3）类型：
琼脂糖凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
由于琼脂糖本身不带电荷， 在凝胶中加入SDS，使蛋白质
血红 蛋白
(4)透 析：
①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有 300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透 析12小时。
②目的：除去样品中分子量较小的杂质。
（二）凝胶色谱操作
1.凝胶色谱 柱的制作
2.凝胶色谱 柱的装填
1.凝胶色谱柱的制作
3.样品的加 入和洗脱
2.缓冲溶液
(1)概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀 释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。
(2)作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本 不变。 (3)配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。
【课堂小结】
血
蛋白质分子的差异性
红 蛋
凝胶色谱法
白
凝胶电泳法
原理
的
提
缓冲溶液
组成
取
和
蛋白质的
样品处理
分 离
提取分离
纯度鉴定
分离过程 作用
粗分离
纯化
【课堂练习】
下列关于DNA粗提取实验和血红蛋白的提取实验,叙述正确的是( A ) A.前者选择鸡血细胞作为实验材料较好,后者选择哺乳动物成熟的红细 胞作为实验材料较好 B.样品预处理时,前者静置1天处理除去上清液;后者需要加入清水,反 复低速短时间离心洗涤,至上清液无黄色 C.在DNA粗提取实验中,往2 mol/L氯化钠溶液中加入蒸馏水析出DNA时, 应该缓慢加入,直到出现黏稠物即止 D.洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐等
（2）原理： 小蛋白质
大蛋白质
混合物 上柱
洗
大分子流动快
收集
脱
小分子流动慢
大分子
收集 小分子
（2）原理： 当不同的蛋白质通过凝胶时
相对分子质量较小 容易进入
凝胶内部的通道
相对分子质量较大
无法进入凝胶 内部的通道 只能在凝胶外部移动
路程较长 移动速度较慢
路程较短 移动速度较快
相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
【方法点拨】
蛋白质分子不能通过半透膜，但溶液中的小分子物质则可以透过 半透膜，因此可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离。
二、实验操作
样品处理 和粗分离
纯化
纯度鉴定
血液组成成分 1.洗涤红细胞 2.释放血红蛋白 3.分离血红蛋白
4.透析血红蛋白
（一）样品处理 1.洗涤红细胞 3g柠檬酸钠
血液 100mL
各种分子在电场中迁移速 解聚成单链，与各种蛋白质
度决定于所带电荷性质的 形成蛋白质－SDS复合物，使
差异及分子的大小、形状 其迁移速度完全取决于分子
的不同
的大小
【典型例题】
蛋白质的分离与提纯技术是蛋白质研究的重要技术，下列有关叙 述不正确的( A ) A．根据蛋白质分子不能通过半透膜的特性，可将样品中各种不同 蛋白质分离 B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳分离 蛋白质 C．根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白 质 D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋 白质
首先通过图片了解血红蛋白的组成，再以鸡血细胞为 例，通过洗涤红细胞，释放血红蛋白，分离血红蛋白，透 析血红蛋白等一系列实验步骤详细了解具体实验，通过实 验提高学生的实际动手能力，并通过实验更好的理解蛋白 质提取与分离，为以后的学习打下良好的基础。
一、基础知识
（一）蛋白质提取与分离的依据－－ 蛋白质的物理化学性质差异
1.分子的形状、大小 4.吸附性质
（二）方法及原理
2.电荷性质和多少 3.溶解度 5.对其他分子亲和力
方法 凝胶色谱法 电泳法
原理 根据相对分子质量的大小分离蛋白质
根据分子带电性质的差异以及分子本 身大小、形状的不同分离蛋白质
1.凝胶色谱法 （1）材料：凝胶
微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。
由 弱 酸 和 相 应 的 强 碱 弱 酸 盐 溶 解 于 水 中 。 如 H2CO3/NaHCO3 ， NaH2PO4/Na2HPO4等。
(4)本实验使用的是磷酸缓冲液(NaH2PO4 /Na2HPO4 ),目的是利
用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能， 便于观察（红色）和科学研究（活性）。
低速离心 2 min
吸出血浆
5倍体积生理盐水
血浆 红细胞
红细胞
重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
搅拌10minΒιβλιοθήκη 2.释放血红蛋白洗涤好的 红细胞导 入烧杯
加蒸馏水 到原血样 体积
加40 ﹪ 体积苯
3.分离血红蛋白
红细胞 混合液
脂类物质 滤纸
充分搅拌 10分钟
高速离心 10min
过滤 离心管
烧杯
有机 溶剂
【方法点拨】 1.血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色 来判断什么时候应该收集洗脱液。
2.血红蛋白的分子量比杂蛋白大，质量越大的，通过凝胶色谱柱的 速度越快。
三、操作提示
1.红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2.色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱
血红蛋白的提取和分离
课题背景
蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以 及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质 组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。 因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科 学研究中经常要做的工作。
课题目标
液不能断流。 3.凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡。
4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。
四、结果分析与评价
1.血液样品的处理 分层明显→样品处理完成 2.凝胶色谱柱的装填
葡聚糖—2000或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整→装填成功。 3.血红蛋白的分离 血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓 慢流出，分离成功。
打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管
2.凝胶色谱柱的装填 固定色谱柱－配凝胶悬液－装填色谱柱－洗涤平衡
磷酸缓冲液 (pH为7.0）
沸水浴加热
紧密 不得有气泡
50cm高
3.样品的加入和洗脱
1.调液面
2.加样 3.再调液面
4.洗脱
缓冲液 凝胶
5.收集
【典型例题】
以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是（ D ） A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂 B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少 C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测 D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢
1.说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法； 2.说明凝胶色谱法的原理和方法； 3.说出电泳的基本原理和方法； 4.运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。
以“蛋白质的合成”为背景材料，设计问题，导入新 课；首先直接阐明蛋白质提取与分离的依据和原理，接着 介绍凝胶色谱法的概念，原理及使用方法；再讲解缓冲溶 液的概念，作用；电泳的概念，原理和类型；然后重点讲 解血红蛋白的提取和分离过程及注意事项；最后通过课堂 总结及课堂检测，完善内化课堂知识。
【方法点拨】
1.提取血红蛋白的实验中,洗涤红细胞时,不能加清水,应该加入生理 盐水,否则细胞会提早释放出血红蛋白与杂质混合,加大提取难度。
2.洗涤红细胞的目的是去除杂质蛋白,以利于血红蛋白的分离和纯化。
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