石蜡包埋组织miRNA做为肿瘤标志物的研究进展

miRNA是一类长为19~25nt小分子单链RNA,其与靶标基因3'UTR结合,通过降解mRNA或抑制其翻译,从而在转录后对靶标基因的表达水平进行调控。

与肿瘤的发生、转移、耐药、预后等密切相关。

目前研究miRNA的样本多来源于新鲜组织和细胞。

最近发现福尔马林固定石蜡包埋的组织(Formalin-fixed and Paraffin-embedded,FFPE)中miRNA保存比较完整并与新鲜组织中的miRNA高度相关[1],为miRNA的研究开辟了一个新的途径。

石蜡组织miRNA可能是一种理想的肿瘤标志物,该文就该领域的最新进展进行综述。

1石蜡包埋组织miRNA中存在miRNA
长期以来,医疗和科研机构采用福尔马林固定和石蜡包埋方法保存病理组织。

现在全世界已保存有大量的石蜡组织样本,覆盖所有已知的疾病。

每个石蜡组织样本都具有特别的价值,关联着大量的病人数据。

所以石蜡组织标本是人类对疾病研究宝贵的信息库,尤其是回顾性研究和少见疾病的研究。

然而通常mRNA甚至DNA、蛋白都有不同程度的降解。

但有研究表明,尽管大分子RNA可能会发生降解,但在一般情况下,小分子RNA 是不受石蜡固定影响。

此外,已有许多研究证实miRNA受FFPE 处理的影响非常小,并且从FFPE样本中提取的microRNA与冷冻组织样本一样,可提供可信的表达谱。

甚至保存长达30年的FFPE样本仍可提供可信的microRNA表达谱数据[2]。

2石蜡包埋组织miRNA的提取
石蜡组织样本可经过异丙醇和乙醇脱蜡后通过trizol法提取总RNA,成本较低。

但普通的过柱法效果较差,可能与过柱时小RNA被吸附有关。

目前已有多种商品化试剂盒用于从FFPE 样本中提取microRNA,例如Ambion公司的RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE,Qiagen公司的miRNeasy FF⁃PE Kit,Norgen公司的FFPE RNA Purification Kit等。

试剂盒提取简单快速,并且易于富集miRNA,但成本较高。

3石蜡组织miRNA的检测
对于发现新的miRNA分子通过小分子RNA建库克隆测序是经典方法。

首先构建cDNA文库,再将这些cDNA进行克隆、测序,然后生物信息学分析,最后将具有发夹结构的小分子RNA 进行Northern杂交以验证。

石蜡组织样本中的已知miRNA检测可以采用miRNA芯片技术,能够发现石蜡组织样本中的miRNA表达谱的差异,利用被筛选出的具有差异的miRNA作进一步研究。

目前已有多种类型的miRNA检测芯片可以选用。

但是基因芯片检测方法的重现性和准确性相对较差,一般多用于初筛,对获得的结果通常需要进一步验证。

RT-PCR技术是目前最常用的验证miRNA的技术,常见的有Taqman探针法、SYBR Green法、茎环RT-PCR法。

也有人采用表面增强拉曼光谱法、磁珠流式检测等。

4石蜡组织miRNA与新鲜组织miRNA的相关性
目前已经有多项研究表明,石蜡组织中的miRNA与新鲜组织的miRNA有良好的相关性,Xiao Zhang[3]将7对匹配的石蜡包埋组织和新鲜冰冻组织进行miRNA检测,spearman相关指数为0.847~0.948。

Jinghuan Li[4]做了类似的研究发现两者的相关系数R20.95,并且认为在总RNA量相当时石蜡中microRNA含量比
新鲜组织多。

有人比较石蜡和冰冻组织micorRNA及mRNA表达的相关性,发现microRNA高度相关,mRNA则较差。

5石蜡包埋组织miRNA在肿瘤检测中的应用
由于石蜡组织中miRNA与新鲜组织中的miRNA有良好的相关性,部分学者利用石蜡组织进行了研究。

Danit Lebanony[5]利用microRNA做为标志物区分鳞癌和其他非小细胞肺癌,其中hsa-miR-205可区分鳞癌和其他非小细胞肺癌的敏感度96%特异性90%。

Nitzan Rosenfeld[6]则通过实验发现石蜡中miRNA不仅保存完好,并且通过miRNA可以区分组织来源。

石蜡包埋组织miRNA做为肿瘤标志物
的研究进展
傅文凡黄豪达江泽勇戴璐赵健
广州医学院附属肿瘤医院肺肿瘤科,广东广州510095
[摘要]miRNA是一类长度为19~25个核苷酸的非编码小分子RNA,从转录后水平调控mRNA的翻译,与肿瘤的发生、转移
和预后进程密切相关。

近年来研究发现,石蜡包埋组织的miRNA仍然保持一定的完整性。

该文就石蜡miRNA作为肿瘤标
志物的研究进展进行综述。

[关键词]miRNA;肿瘤;生物标志物
[中图分类号]R73[文献标识码]A[文章编号]1674-0742(2013)08(a)-0196-02
[基金项目]广州医学院青年基金项目(项目编号:2010A28)。

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miRNA与mRNA相比较小、不易降解、缺乏poly A加尾结构,因此受福尔马林固定和石蜡包埋等处理的影响要小。

石蜡样本miRNA的特点有利人类更好的利用现有的最大标本库,为探讨肿瘤的发生、发展、预后等等提供又一有力手段。

[参考文献]
[1]Wang F,Wang L,Briggs C,et al.DNA degradation test predicts success in whole-genome amplification from diverse clinical samples[J].J Mol Diagn,2007,9(4):441-451.
[2]von Ahlfen S,Missel A,Bendrat K.Determinants of RNA quality from FFPE samples[J].PLoS One,2007,5,2(12):1261.
[3]Zhang X,Chen J,Radcliffe T,et al.An array-based analysis of microRNA
expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-em⁃bedded human tissue samples[J].J Mol Diagn,2008,10(6):513-519.
[4]Li J,Smyth P,Flavin R,et parison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE)cells and snap frozen cells[J].BMC Biotechnol, 2007,29(7):36.
[5]Lebanony D,Benjamin H,Gilad S,et al.Diagnostic assay based on hsa-miR-205expression distinguishes squamous from nonsquamous non-small-cell lung carcinoma[J].J Clin Oncol,2009,27(12):2030-2037.
[6]Rosenfeld N,Aharonov R,Meiri E,et al.MicroRNAs accurately identify cancer tissue origin[J].Nat Biotechnol,2008,26(4):462-469.
(收稿日期:2013-06-27)
运输过程紊乱、离子和能量代谢紊乱等,最终导致疲劳感。

3.2病毒感染
目前许多研究认为EB病毒、柯萨奇B组病毒、异嗜性小鼠白血病病毒相关病毒的逆转录病毒、博尔纳病毒、肠道病毒、流感病毒和巨细胞病毒等多种病毒可能与CFS有关。

到目前为止,关于慢性疲劳综合征患者感染EB病毒、博尔纳病毒、人类疱疹病毒、肠道病毒、流感病毒等的血清学证据已多见报道,但是还没足够的证据证明单种病毒因素或多种病毒因素共同作用与CFS有直接关联。

3.3内分泌功能异常
下丘脑-垂体-肾上腺是人体重要的神经内分泌器官,提供了一个将神经信息转换成生理反应的模式,在应激反应中起着重要的作用。

目前已发现CFS患者HPA轴的负反馈调节不良,认为可能是由于促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)活性下降造成的。

近年来随着研究的深入,发现CFS患者可能存在皮质醇激素昼夜节律分泌或代谢的紊乱。

3.4自身免疫功能异常
多数CFS患者存在免疫系统功能紊乱,因此也将CFS称为“慢性疲劳免疫功能障碍综合征”(Chronci Fatigue Immune Dys⁃function Syndrome,CFIDS)。

自身免疫功能异常可表现为:①体液免疫的改变。

有报道显示,CFS患者免疫球蛋白IgA、IgG、IgM、IgD的数量减少,但也有报道称IgG水平升高。

②细胞免疫的改变。

Maher KJ用血细胞荧光计数检测CFS患者细胞内的穿孔素含量,与正常人相比,NK细胞内穿孔素显著减少。

③细胞因子水平的改变。

罗英华等研究发现,CFS患者血清中TNF-α、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的释放增多。

4CFS的治疗
4.1营养疗法
补充维生素和其他微量元素对CFS具有预防和治疗的双重作用。

由于CFS的发生可引起氧化损伤,提示我们可以用抗氧化营养素进行治疗。

常见的抗氧化营养素有硒、维生素A、维生素C 和维生素E等。

这类营养素均能阻止自由基的过氧化损伤。

Sumida研究发现,当维生素E缺乏,运动时体内过氧化脂质及血清丙二醛水平升高,而补充VE可以抑制运动中LPO产生、降低血清MDA水平,从而达到缓解CFS患者体力疲劳的目的。

CFS 患者还可补充B族维生素。

Heap通过研究报告12例患有CFS 的病人体内B族维生素的含量显著低于18例健康对照组的水平,补充B族维生素后其疲劳感明显缓解,学习记忆能力明显好转,免疫功能显著增强。

4.2祖国医学
祖国医学包括了中药治疗和外治法。

中药主要是针对CFS 患者的机体失衡状态的原因,运用整体观念和辨证论治的理论治疗CFS,从而恢复机体正常功能状态。

外治法主要有针灸、推拿、拔罐等,这些方法可通过疏通经络、调节气血、提高机体免疫机能等作用来达到治疗CFS的目的。

4.3心理疗法
要正确面对各种压力,调整心态,不断提高自身的心理承受能力和自我调适能力,改善心理素质,使心理状态尽可能地保持平衡。

认知疗法有助于促进患者的认知转变,时刻保持一种积极、乐观、向上的良好状态,保持愉快稳定的健康情绪。

5CFS的展望
慢性疲劳综合征已成为21世纪影响人类健康的主要问题之一,目前广泛受到国内外医学界的关注。

然而目前对CFS的研究还存在一些不足:到目前为止国内尚没有大面积和大范围针对CFS流行病学的调查和分析;CFS的病因、发病机制还尚未研究清楚;临床上缺乏治疗CFS和高危人群预防的统一方案。

希望随着CFS的深入研究,能充分认识其致病因素及发病机制,从而为CFS患者的治疗提供更加有力的科学依据。

[参考文献]
[1]李莉,卢洪洲.慢性疲劳综合征研究进展[J].内科理论与实践,2009,4 (4):331-333.
[2]Holmes GP,Kaplan JE,Gantz NM,et al.Chronic fatigue syndrome:a working case definition[J].Ann Intern Med,1988(108):387-389. [3]冯利红.慢性疲劳综合征的研究进展[J].中国慢性病预防与控制, 2006,14(6):457-460.
(收稿日期:2013-06-08)
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