目的蛋白表达与纯化protocol

目的蛋白表达与纯化protocol
小量表达测试：
1、挑一单克隆到3ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。

2、保种：700μl菌液+400μl 80%灭菌甘油，充分混匀后置于-800C保存。

3、扩大培养：以1:100接菌，即取50μl菌液到5ml LB（含抗生素）中，370C，
220rpm振荡培养2h~3h至OD值达到0.6。

4、对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。

对照
5、另取1ml菌液于一新的试管中，加1/1000 IPTG（终浓度为1mM），370C，220rpm
振荡培养3h后收菌：12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。

370C样品
6、其余约3ml菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000 IPTG（终
浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：12000rpm 离心1min，弃尽上清，-200C保存。

160C样品
7、Bugbuster分别处理上述三个样品，取20μl总蛋白，其余离心后分离上清和
沉淀，进行SDS-PAGE电泳鉴定，上样顺序为：
对照370C样品160C样品总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀
若目的蛋白在上清中有表达，则可以进行大量表达与纯化，具体操作如下。

大量表达：
1、挑一单克隆到7.5ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。

注意：此步用50ml离心管摇菌！
2、扩大培养：以1:100接菌，即取将上述7.5ml菌液全部接到750ml TB（含抗
生素）中，370C，220rpm振荡培养4h~5h至OD值达到1.0。

3、对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。

（对
照）
4、其余约菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000 IPTG（终浓度
为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：6000rpm、40C离心10min，弃尽上清，取一点沉淀做表达鉴定（160C样品），其余-200C 保存。

5、Bugbuster分别处理上述两个样品，进行SDS-PAGE电泳鉴定。

（同小量表达
中的7）
菌体破碎（高压破菌法）：
1、若目的蛋白在上清中有表达，则可取剩余菌体N g (根据目的蛋白的表达量而
定)，用4-6×N ml的lysis buffer将菌体重悬，加入0.1mM的PMSF，置于50/100ml小烧杯中，并将烧杯置于冰上。

2、用超声破碎仪进行破碎，功率一般为100W~200W，超声时间为3s，间隙时
间为5s，工作次数一般为99×4次。

3、将破碎后的菌液移入50ml BECKMAN高速离心管中，18000rpm、40C离心
30-40min，将上清移入一个新的50ml离心管中。

Ni柱亲和层析：
Lysis buffer: 50mM Tris, 300mM NaCl, pH 8.0（可加入5-10%的甘油和1mMdTT，20mM咪唑）
Wash buffer: 50mM Tris, 300mM NaCl, 20mM 咪唑, pH 8.0
Elution buffer: 50mM Tris, 300mM NaCl, 500mM 咪唑, pH 8.0
1、取适量的beads灌入玻璃柱中，用大量的ddH2O冲洗beads，一般为10CV×
5（CV代表柱体积，下同）。

2、用lysis buffer进行平衡：10CV×5。

3、将平衡好的beads移入菌体破碎最后得到的上清中，Mix 1~2h。

4、500g，40C离心2min，收集上清——flow-through。

5、加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清——wash 1。

6、加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清——wash 2。

7、加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清——wash 3。

8、将beads灌入玻璃柱中，继续用wash buffer洗10CV×3。

9、用Elution buffer洗脱：0.5CV×10，用EP管分别收集eluates。

10、SDS-PAGE电泳鉴定。

Resin regeneration:
1、用0.1M EDTA洗2CV（清洗至beads为无色）。

2、ddH2O洗5CV。

3、0.1M NaOH洗2CV。

4、ddH2O洗5CV。

5、加2CV的NiCl2。

6、ddH2O洗5CV。

7、用20%乙醇洗2次beads，置于4~80C保存。

GST柱亲和层析：
Lysis buffer: 1×PBS (140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.3)
Wash buffer: 1×PBS
Elution buffer: 50mM Tris, 10mM reduced glutathione, pH 8.0
1、取1ml的beads灌入玻璃柱中，用大量的ddH2O冲洗beads。

2、用lysis buffer进行平衡：10CV×5。

3、将平衡好的beads移入菌体破碎最后得到的上清中，Mix 1~2h。

4、500g，40C离心2min，收集上清——flow-through。

5、加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清——wash 1。

6、加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清——wash 2。

7、加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清——wash 3。

8、将beads灌入玻璃柱中，继续用wash buffer洗10CV×3。

9、用Elution buffer洗脱：0.5CV×10，用EP管分别收集eluates。

10、SDS-PAGE电泳鉴定。

Resin regeneration:
1、用6M guanidine hydrochloride洗2个柱体积。

2、立即用1×PBS洗5个柱体积。

3、用70%乙醇洗3~4个柱体积。

4、立即用1×PBS洗5个柱体积。

5、用20%乙醇洗2次beads，置于4~80C保存。

Strep·Tactin柱亲和层析：
Wash buffer: 100mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, pH 8.0
Elution buffer:100mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 2.5mM desthiobiotin, pH 8.0
1、取适量的beads灌入玻璃柱中。

2、用wash buffer进行平衡：10CV×5。

3、将破碎后的上清灌入装有beads的玻璃柱中，控制流速为1滴/2s，收集
flow-through，再重复上样一次。

4、用wash buffer冲洗：1CV×5，收集washes。

5、用Elution buffer洗脱：0.5CV×6，用EP管分别收集eluates。

6、SDS-PAGE电泳鉴定。

Resin regeneration:
Regeneration buffer: 100mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM HABA, pH 8.0
1、用regeneration buffer冲洗柱子，5CV×3，直到柱子变为红色且颜色均一。

2、加2CV wash buffer或regeneration buffer，置于4~80C保存柱子。

凝胶过滤层析（Superdex 75/200）：
Binding buffer: 20mM HEPES, 100mM NaCl, pH 7.0
1、ddH2O冲洗2CV: flow rate: 1ml/min, Alarm_pressure: 0.3MPa（下同）。

2、binding buffer平衡2CV。

3、样品离心：12000rpm, 40C离心30min。

4、冲洗loop: ddH2O洗5个体积，binding buffer洗5个体积。

5、上样（injection）：用注射器上样，一定要排尽注射器里的气泡。

6、Binding buffer继续洗脱约40min后，开始注意观察紫外吸收峰的出现，一旦
出峰立即开始收集。

7、样品收集完毕后，继续用binding buffer冲洗直到紫外吸收基线水平。

8、ddH2O冲洗2CV。

9、20%乙醇冲洗2CV后暂停，关闭仪器。